Функции на рестрикционните ензими, механизъм на действие, видове и примери



на рестрикционни ензими те са ендонуклеази, използвани от някои археи и бактерии, за да инхибират или "ограничават" разпространението на вируси вътре в тях. Те са особено често срещани при бактериите и са част от тяхната защитна система срещу чужда ДНК, известна като система за ограничаване / модификация.

Тези ензими катализират рязането на двойно-усукана ДНК в специфични места, възпроизводимо и без използване на допълнителна енергия. Повечето изискват присъствието на кофактори като магнезий или други двувалентни катиони, въпреки че някои изискват също ATP или S-аденозил метионин.

Рестрикционните ендонуклеази са открити през 1978 г. от Даниел Натанс, Арбер Вернер и Хамилтън Смит, които са получили Нобелова награда за медицина за тяхното откритие. Името му обикновено произлиза от организма, където се наблюдават за първи път.

Такива ензими се използват широко в разработването на методи за клониране на ДНК и други стратегии на молекулярната биология и генното инженерство. Характеристиките му за разпознаване на специфични последователности и способността за изрязване на последователности в близост до местата на разпознаване ги правят мощни инструменти в генетичните експерименти.

Фрагментите, получени от рестрикционни ензими, които действат по-специално ДНК молекула, могат да бъдат използвани, за да пресъздаде "карта" на оригиналната молекула чрез използване на информация за където ензимът намали ДНК.

Някои рестрикционни ензими могат да имат едно и също място на разпознаване в ДНК, но не е задължително да го разрязват по същия начин. По този начин, съществуват ензими, които правят разфасовки, оставяйки тъпи краища и ензими, които отрязват оставащи кохезионни цели, които имат различни приложения в молекулярната биология.

Понастоящем има стотици различни търговски достъпни рестрикционни ензими, предлагани от различни търговски къщи; тези ензими работят като „обичайни“ молекулярни ножици за различни цели.

индекс

  • 1 Функции
  • 2 Механизъм на действие
  • 3 вида
    • 3.1 Рестрикционни ензими от тип I
    • 3.2 Рестрикционни ензими от тип II
    • 3.3 Рестрикционни ензими от тип III
    • 3.4 Рестрикционни ензими от тип IV
    • 3.5 Тип V рестрикционни ензими
  • 4 Примери
  • 5 Препратки

функции

Рестрикционни ензими изпълнява обратната функция на полимерази, тъй като те се хидролизират или се прекъсне естерната връзка на връзката фосфодиестер между съседни нуклеотиди на нуклеотидната верига.

В молекулярната биология и генното инженерство те са широко използвани инструменти за конструиране на експресионни и клониращи вектори, както и за идентифициране на специфични последователности. Те са полезни и за изграждането на рекомбинантни геноми и имат голям биотехнологичен потенциал.

Последните постижения в генната терапия правят общо ползване на рестрикционни ензими за вкарване на гени в определени вектори, които са средства за превоз на такива гени в живите клетки, и вероятно имат способността да бъдат включени в клетъчния геном на постоянни промени.

Механизъм на действие

Рестрикционните ензими могат да катализират рязането на двойноверижната ДНК, въпреки че някои от тях са способни да разпознаят едноверижни ДНК последователности и дори РНК. Нарязването се извършва след разпознаването на последователностите.

Механизмът на действие се състои в хидролиза на фосфодиестерната връзка между фосфатна група и дезоксирибоза в гръбнака на всяка верига на ДНК. Много от ензимите са в състояние да режат на същото място, което те разпознават, докато други прерязват между 5 и 9 двойки бази преди или след него..

Обикновено тези ензими се нарязват на 5 'края на фосфатната група, като се получават ДНК фрагменти с 5' фосфорилен край и терминален 3 'хидроксилен край..

Тъй като протеините не влизат в пряк контакт с мястото на разпознаване в ДНК, те трябва да бъдат преместени последователно, докато достигнат специфичното място, може би с помощта на "плъзгащи" механизми на ДНК веригата..

По време на ензимния разрез фосфодиестерната връзка на всяка от веригите на ДНК е позиционирана в един от активните места на рестрикционните ензими. Когато ензимът напуска мястото за разпознаване и рязане, той го прави чрез неспецифични преходни асоциации.

тип

Понастоящем са известни пет вида рестрикционни ензими. По-долу е кратко описание на всяко от тях:

Тип I рестрикционни ензими

Тези ензими са големи пентамерни протеини с три субединици, ограничение, метилиране и друго за разпознаване на последователности в ДНК. Тези ендонуклеази са мултифункционални протеини, способни да катализират рестрикционни и модифициращи реакции, те имат АТФазна активност и също ДНК топоизомераза.

Ензимите от този тип са първите ендонуклеази, които трябва да бъдат открити, те са пречистени за първи път през 60-те години и оттогава те са изучавани с голяма дълбочина..

Тип I ензими не са широко използвани като биотехнологично инструмент, тъй като мястото на разцепване може да бъде с променлива разстояние до място за разпознаване около 1000 базови двойки, което ги прави ненадеждни да експериментален възпроизводимост.

Рестрикционни ензими от тип II

Те са ензими, съставени от хомодимери или тетрамери, които отрязват ДНК в определени места с дължина между 4 и 8 bp. Тези места за рязане обикновено са палиндромни, т.е. разпознават последователности, които се четат по един и същи начин в двете посоки.

Много от рестрикционните ензими от тип II в бактериите отрязват ДНК, когато разпознават техния чужд характер, тъй като не притежават типичните модификации, които трябва да притежава собствената ДНК..

Това са най-простите рестрикционни ензими, тъй като те не изискват друг кофактор, различен от магнезий (Mg +), да разпознават и отрязват ДНК последователностите..

Точността на рестрикционните ензими от тип II в разпознаването и рязането на прости последователности в ДНК в точни позиции ги прави една от най-използваните и незаменими в повечето области на молекулярната биология.

В групата от тип II рестрикционни ензими са множество подкласове, класифицирани според определени свойства, които са уникални за всеки един. Класификацията на тези ензими се извършва чрез добавяне на букви от азбуката, от А до Я, следвайки името на ензима..

Някои от най-известните подкласове за тяхната полезност са:

Подклас IIA

Те са димери на различни субединици. Те разпознават асиметрични последователности и се използват като идеални прекурсори за генериране на ензими за рязане.

Подклас IIB

Те са съставени от още един димер и отрязват ДНК от двете страни на последователността на разпознаване. Те отрязват двете нишки на ДНК в диапазона от базови двойки извън мястото на разпознаване.

Подклас IIC

Ензимите от този тип са полипептиди с функции на разделяне и модификация на ДНК вериги. Тези ензими отрязват двете нишки асиметрично.

Подклас IIE

Ензимите от този подклас са най-използвани в генното инженерство. Те имат каталитичен сайт и обикновено изискват алостеричен ефектор. Тези ензими трябва да взаимодействат с две копия на тяхната последователност на разпознаване, за да направят ефективен разрез. В този подклас са ензимите EcoRII и EcoRI.

Рестрикционни ензими от тип III

Рестрикционните ендонуклеази от тип III са съставени само от две субединици, едната е отговорна за разпознаване и модифициране на ДНК, а другата е отговорна за изрязването на последователността.

Тези ензими изискват два кофактора за тяхното функциониране: АТФ и магнезий. Рестрикционните ензими от този тип притежават две асиметрични места на разпознаване, транслоцират ДНК по ATP-зависим начин и го срязват между 20 до 30 bp в близост до мястото на разпознаване..

Тип IV рестрикционни ензими

Ензимите от тип IV са лесни за идентифициране, тъй като отрязват ДНК с етикети за метилиране, те се състоят от няколко различни субединици, които са отговорни за разпознаването и отрязването на ДНК последователността. Тези ензими използват като кофактори GTP и двувалентен магнезий.

Специфичните места за рязане включват нуклеотидни вериги с остатъци от метилиран или хидроксиметилиран цитозин в една или и двете вериги на нуклеинови киселини..

Тип V рестрикционни ензими

Тази класификация групира ензимите тип CRISPER-Cas, които идентифицират и отрязват специфични ДНК последователности от нахлуващи организми. Cas ензимите използват нишка на CRISPER синтезирана насочваща РНК, която разпознава и атакува инвазивните организми.

Ензимите, класифицирани като тип V, са полипептиди, структурирани от ензими тип I, II и II. Те могат да отрязват части от ДНК на почти всеки организъм и с голям диапазон на дължина. Тяхната гъвкавост и лекота на употреба правят тези ензими един от най-често използваните инструменти в генното инженерство днес заедно с ензимите от тип II..

Примери

Рестрикционните ензими са използвани за откриване на ДНК полиморфизми, особено в населението генетични проучвания и еволюционни изследвания, използващи митохондриална ДНК, за да се получи информация за цени нуклеотидни замествания.

Понастоящем векторите, използвани за трансформация на бактерии с различни цели, имат мултиклонални сайтове, където са открити сайтове за разпознаване на множество рестрикционни ензими..

Сред тези ензими, най-популярни са EcoRI, II, III, IV и V, получени и описани за първи път. Е. coli; HindIII, от H. influenzae и BamHI's B. amyloliquefaciens.

препратки

  1. Bickle, T.A., & Kruger, D.H. (1993). Биология на рестрикцията на ДНК. Микробиологични прегледи, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A., & Horvath, P. (2007). CRISPR Осигурява придобита резистентност срещу вируси в прокариотите. наука, 315(Март), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Молекулната перспектива: рестрикционни ендонуклеази. Стволови клетки Основи на раковата медицина, 20, 190-191.
  4. Halford, S.E. (2001). Прескачане, скачане и увиване чрез ограничителни ензими. Сделки на биохимичното общество, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Поддържане на идентичността на видовете и контролиране на видообразуването на бактериите: нова функция за системите за ограничаване / модифициране? ген, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Геви на Левин XII (12 изд.). Бърлингтън, Масачузетс: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... Тя, Q. (2015). Включване на тип I и тип III CRISPR-Cas системи за редактиране на геном. Изследване на нуклеинови киселини, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D.T.F., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). Тип I рестрикционни ензими и техните роднини. Изследване на нуклеинови киселини, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Рестрикционни ендонуклеази в анализа и преструктурирането на ДНК молекули. Annu. Rev. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). ДНК полиморфизъм, откриваем чрез рестрикционни ендонуклеази. генетика, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, М., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Клетъчни и молекулярни науки за живота Тип II рестрикционни ендонуклеази: структура и механизъм. CMLS Клетъчни и молекулярни науки за живота, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Как рестрикционните ензими станаха работници на молекулярната биология. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R.J., & Murray, K. (1976). Рестрикционни ендонуклеази. Критични рецензии в биохимията, (Ноември), 123-164.
  14.  Stoddard, B.L. (2005). Структура и функция на хонинговащата ендонуклеаза. Тримесечни прегледи на биофизиката, 1-47.
  15.  Tock, М. R., & Dryden, D.T.F. (2005). Биологията на ограничението и анти-ограничението. Текущо мнение в микробиологията, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G., & Murray, N.E. (1991). Системи за ограничаване и модифициране. Annu. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z. & Mou, K. (2016). Геномни прозрения за вирулентността на Campylobacter jejuni и популационната генетика. Заразяват. Dis. Transl. Мед., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Структура и механизъм на мултифункционални рестрикционни ендонуклеази. Annu. Rev. Biochem., 50, 285-315.