Характеристики и подготовка на бактериални намазки



на бактериална намазка е удължение във формата на тънък филм от суспензия от бактериални микроорганизми, която се извършва върху прозрачна стъклена плоча или диапозитиви, за наблюдение под оптичен микроскоп.

Разширението във формата на филм се извършва с цел да се разделят микроорганизмите колкото е възможно повече, защото ако са групирани, наблюдението не е ясно.

В изследването на бактериалните култури се използват техники за подготовка на намазка, фиксация и оцветяване, за да се анализират по-добре. Поради малкия размер на микроорганизмите е необходимо използването на оптичен микроскоп за неговото наблюдение.

Оптичните микроскопи са незаменими инструменти за наблюдение на размазването. Те използват оптични лещи и светлина, позволяващи визуализация на пробите с голямо увеличение на размера.

Като цяло, живите клетки нямат структури, които са предимно оцветени, виждат се през оптичния микроскоп, те са безцветни, прозрачни проби и показват много малък вътрешен контраст и с околностите им.

Наблюдението с обикновен светлинен микроскоп, без използването на помощни техники за оцветяване, е много ограничено и се използва само в някои случаи, както при наблюдението на движението на микроорганизми..

За да се наблюдават оптимално микроорганизмите, трябва да се постигне баланс между контраста и разделителната способност. Детайлите на клетките не могат да бъдат наблюдавани под микроскоп, дори при висока резолюция; използването на багрила се изисква чрез техники за оцветяване, които осигуряват контраст за наблюдение.

индекс

  • 1 Характеристики на доброкачествена бактериална намазка
    • 1.1 Отличен контраст
    • 1.2 Добро решение
    • 1.3 Добро оцветяване
  • 2 Подготовка
    • 2.1 A. Frotis
    • 2.2 Б. Фиксиране
    • 2.3 C. Обикновено оцветяване
    • 2.4 D. Окончателно запазване на намазката
  • 3 Препратки

Характеристики на доброкачествена бактериална намазка

Отличен контраст

За да се постигне отличен контраст, се наричат ​​сложни микроскопи фазово-контрастен микроскоп, диференциална интерференция и тъмен микроскоп. Този тип микроскоп се използва за наблюдение на бактериални структури като обвивки и нишки, наред с други.

Оцветяването е проста техника за увеличаване на контраста, който се постига с микроскоп с ясна област. При тази техника могат да се използват различни багрила, които значително подобряват наблюдението под микроскопа.

Петната се правят директно върху намазките или удълженията на суспензиите от микроорганизми върху предметните стъкла, предварително изсушени и фиксирани..

Добър фикс

Фиксирането е техника, която се използва за запазване на клетъчните структури; причинява инактивиране на микроорганизмите и адхезия към стъклото на предметното стъкло. Има различни фиксационни процедури: фиксиране на топлината и химична фиксация.

Фиксиране на топлината

Това е методът, който се използва най-често при наблюдението на бактериална намазка. Техниката се състои в преминаване на бактериалната суспензия на намазката от пламъка на запалката. Тази техника е в състояние да запази външната морфология на бактериите, но разрушава техните вътрешни структури.

Химично фиксиране

Химичното фиксиране използва химикали в консервацията, като формалдехид или формалдехид, етанол и оцетна киселина, наред с други. Предимството на използването на химически фиксиращи средства е постигането на запазване на вътрешните клетъчни структури на микроорганизмите.

Добро оцветяване

Най-често срещаните процедури за оцветяване на предварително изсушен и фиксиран намазка са положително или просто оцветяване, диференциално оцветяване и отрицателно оцветяване. Има и специални техники за оцветяване на специфични клетъчни структури (капсула, спора, флагела).

Положително оцветяване или просто оцветяване

Положителното или просто оцветяване е най-използваната техника за оцветяване на петна. Използва багрила, които имат способността да се свързват с определени микробни структури, позволявайки им да бъдат наблюдавани под микроскоп.

Тези багрила имат хромофорни групи (оцветена част) в тяхната химична структура, с променливи двойни връзки и прости връзки (конюгиране). Тези връзки могат на свой ред да създадат йонни или ковалентни връзки с някои клетъчни структури.

Използваните багрила за положително или просто оцветяване са предимно химически производни на анилин (цветни органични соли).

От друга страна, сред оцветителите можем да открием някои с основно рН и други с киселинно рН.

Основни оцветители

В основните багрила, хромофорната група има положителен електрически заряд. По-голямата част от прокариотните микроорганизми имат неутрално вътрешно рН и тяхната клетъчна повърхност е отрицателно заредена. Чрез това електростатично взаимодействие хромофорът се свързва с клетката и я боядисва.

Примери за основни багрила са метиленово синьо, виолетово кристално, малахитово зелено, основно фузин, сафранин, наред с други.

Киселинни багрила

В киселите бои хромофорната група има отрицателен електрически заряд. Те се използват за оцветяване на протеини с положително заредени аминогрупи. Примери за кисели багрила са кисели фузин, роза Бенгал, конго червено и еозин.

Диференциално оцветяване

Техниката на диференциално оцветяване се състои в нанасяне на две оцветители с различен цвят или интензитет, за да се разграничат различни микроорганизми под микроскопа. Грам оцветяването и оцветяването с киселинно-алкохолна устойчивост са най-използваните диференциални петна в бактериологията.

Грам оцветяване се използва като предварителен тест за да се знае формата, размера, клетъчното групиране, в допълнение към вида на клетъчната стена. Чрез теста за оцветяване по Грам, бактериите с клетъчна стена се класифицират като грам-положителни бактерии и грам-отрицателни бактерии.

Отрицателно оцветяване

В тази техника се използват химически багрила, които не проникват в клетъчния интериор, но правят това средата, в която микроорганизмите се появяват като черен фон.

В техниката на отрицателното оцветяване, намазката се прави с капка суспензия от китайско мастило или нигрозин, която след разрешаване на сушенето при стайна температура образува филм, непрозрачен за преминаването на светлината. По този начин микроорганизмите се наблюдават като ярки форми на тъмен фон.

подготовка

А. Намазване

1.- Измийте слайдовете много добре, подсушете с абсорбираща хартия и ги маркирайте. Етикетът трябва да посочва съдържанието на препарата, датата и името на лицето, което го е обработило.

2.- Запалете запалката и стерилизирайте инокулационната верига в пламъка до горещо.

3.- Оставете дръжката хладна.

4.- Вземете тръбата на бактериалната култура, свалете капачката и бързо преминете през устата на тръбата близо до пламъка на запалката (пламък).

5. Въведете инокулационната верига вътре в епруветката, съдържаща бактериалната култура, и вземете пробата.

6. Ако културата е в течна среда, вземете пробата, взета с дръжката в центъра на предметното стъкло, и я разпръснете внимателно в кръг с диаметър приблизително 2 cm..

7.- Стерилизирайте отново цикъла за инокулация.

8. Оставете изсъхването на намазка във въздуха.

9.- Повторете стъпки 3 до 8 три пъти.

10. Ако културата е в твърда среда, на слайда трябва предварително да се постави капка дестилирана вода. Това се прави, за да се смеси малка проба от културата, взета с дръжката за инокулация, съгласно показанията на стъпки 2 до 5 (условия на асепсия).

11.- Изтеглете разредената проба с водата върху слайда и повторете три пъти.

B. Фиксиране

1. Добавя се към сухата намазка, произведена от култури в течна среда, две капки метанол или абсолютен етанол..

2.- Оставете да изсъхне във въздуха от запалката.

3. Ако мазилката идва от култура в твърда среда, сухото намазка се фиксира с топлина, преминавайки 2 до 3 пъти бързо през най-горещата зона на пламъка на запалката..

4. - Докоснете долната част на намазката с дорзалната част на лявата ръка (за дясната, иначе използвайте дясната ръка) и проверете дали е студено.

C. Обикновено оцветяване

1. Добавете 2 капки от избраната боя към размазването и го оставете да действа за времето, необходимо в специфичните протоколи на всяко багрило (обикновено между 1 и 5 минути)..

Някои багрила изискват използването на топлина за тяхното активиране, в който случай е необходимо да се внимава при нагряване на плъзгача в пламъка на запалката (манипулиране с пинсети и избягване на кипене). Прегряването на намазка може да унищожи клетките, които искате да наблюдавате.

3. Отстранете излишното багрило чрез измиване с дестилирана вода от пикет. Отстранете промивната вода, като леко почукате плъзгача по ръба му, наклони се на работната маса.

4.- Оставете въздушно сушене.

5.- В зависимост от вида наблюдение, на този етап се използва покривно стъкло. Покривката предпазва и запазва размазването. Ако на този етап е направено наблюдение чрез потапяне в масло, не се използва покривно стъкло, но намазката не може да бъде запазена.

Г. Окончателно запазване на намазката

1. Потапя се последователно във всяко от разтворите, посочени по-долу, за минимум 5 минути. Целта на тези "бани" е да оставят намазката напълно дехидратирана. Всеки реагент трябва да се източи, преди въвеждането на намазка в следващата баня.

Редът на дехидратиращите вани е както следва:

  1. Етанол 70%
  2. 95% етанол
  3. Чист ацетон
  4. Смесва се ацетон-ксилол 1: 1
  5. ксилол

След това оставете да изсъхнат.

2. Монтирайте покривалото, за предпочитане 22 × 22 mm, като използвате канадски балсам или други средства за сглобяване.

препратки

  1. Briggs, G. (1965). Причинни фактори при микробиологични лабораторни злополуки и инфекции. Биологични лаборатории на американската армия. Форт Детрик.
  2. Cappucino, J.G. и Welch, C.T. (2017). Микробиология: Ръководство за лаборатория. Pearson.
  3. Holt, J.G. Редактор. (1977). По-краткият наръчник на Bergey за детерминативна бактериология. 8тата Балтимор: Уилямс и Уилкинс Ко.
  4. Johnson, T.R. и дело; C.L. (2018). Лабораторни експерименти в микробиологията. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Диагностична микробиология. 14тата Сейнт Луис, САЩ: Elsiever, Inc..