Основа, подготовка и употреба на бульон от урея



на бульон от карбамид е течна културална среда, използвана за демонстриране наличието на ензима уреаза в някои микроорганизми. Urease е микробен ензим, който се произвежда конститутивно, т.е. той се синтезира независимо от това дали е налице субстрата, върху който той действа или не..

Функцията на уреазата е свързана с разлагането на органични съединения. Не всички микроорганизми са способни да синтезират този ензим, поради което неговото определяне в лабораторията позволява да се идентифицират определени бактериални щамове и дори да се разграничат видовете от един и същи род..

Има два вида тест за урея: Стюарт и Кристенсен. Те се различават по състав и чувствителност. Първият е специален, за да се покаже голямо количество уреаза, произведена от видове от рода Proteus.

Вторият е по-чувствителен и може да открие малки количества уреаза, генерирана късно от други бактериални родове, като Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter и Mycobacterium.

Стюартният бульон се състои от карбамид, натриев хлорид, дикалиев фосфат, монокалиев фосфат, дрождев екстракт, фенолово червено и дестилирана вода..

Докато бульонът на Christensen или агар-урея се състои от пептони, натриев хлорид, монокалиев фосфат, глюкоза, карбамид, фенолово червено, дестилирана вода и агар-агар. Последното само ако е твърда среда.

индекс

  • 1 Фондация
    • 1.1 Бульон на Стюарт карбамид
    • 1.2 Бульон на Christensen или агар-карбамид
    • 1.3 Тълкуване на двете медии (Стюарт и Кристенсен)
  • 2 Подготовка
    • 2.1 Бульон Стюарт карбамид
    • 2.2. Кристален бульон или агар-карбамид
  • 3 Използване
  • 4 Засяване на теста за урея
  • 5 Контрол на качеството
  • 6 Препратки

фундамент

Ензимът уреаза хидролизира уреята, за да образува въглероден диоксид, вода и две молекули амоняк. Тези съединения реагират, за да образуват крайния продукт, наречен амониев карбонат.

Бульон на Стюарт урея

Стюартният бульон от урея е по-буфериран с рН 6,8. Следователно, микроорганизмът трябва да може да образува големи количества амоний, за да превърне червеното в фенол. РН трябва да се повиши над 8.

Следователно бульонът Stuart urea е селективен за Proteus видове, даващ положителни резултати за 24 до 48 часа инкубация и не е ефективен за бактерии, които произвеждат малки количества уреаза или бавно хидролизират урея \ t.

Това е така, защото видовете Proteus могат да използват урея като източник на азот. За разлика от другите бактерии, които произвеждат уреаза, се нуждаят от допълнителен източник.

Обаче, Pérez et al. (2002) определят, че бульонът на Стюарт урея е толкова ефективен, колкото уреа агар от Кристенсен, за да се определи уреазата в дрождевите щамове от родове Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon и Saccharomyces..

Авторите на изследването твърдят, че са постигнали 100% съвпадение с двете медии (Stuart и Christensen) чрез инкубиране за 24 и 48 часа; с уговорката, че са взели като положителни щамовете, които са успели да превърнат медиите в силен розово-фуксиен цвят.

Това изясняване е необходимо, тъй като Lodder (1970) потвърждава, че почти всички дрожди успяват да поставят фаската на карбамидния агар на Christensen в бледо розово. Това е така, защото те могат да хидролизират урея в минимални количества и да образуват амини чрез окислително декарбоксилиране на аминокиселините на повърхността. Това не трябва да се тълкува като положително.

Бульон или карбамиден агар от Christensen

Бульонът или агарът на Christensen карбамид е по-малко буфериран, като е в състояние да открие малки количества амоний. В допълнение, тази среда е обогатена с пептони и глюкоза. Тези съединения причиняват развитието на други микроорганизми, произвеждащи уреаза, които не растат в бульон Стюарт.

Аналогично, тестът на Christensen urea предлага по-бързи резултати, особено за Proteus, тъй като е в състояние да даде силно положително действие само за 30 минути като минимално време и до 6 часа като максимално време..

Останалите микроорганизми, произвеждащи уреаза, успяват леко да превърнат цвета на средата след 6 часа, и силно след 24, 48, 72 часа или повече, и дори някои щамове могат да дадат слаби реакции след 5 или 6 дни.

Тълкуване на двете медии (Стюарт и Кристенсен)

Средата е първоначално жълто-оранжева на цвят и положителна реакция ще превърне цвета на средния в розово-фуксия. Интензивността на цвета е право пропорционална на количеството произведен амоний.

Отрицателна реакция ще остави средата на оригиналния цвят, с изключение на дрождите, които могат да дадат бледо розово с Christensen urea agar.

подготовка

Бульон на Стюарт урея

Претеглете необходимите грамове според указанията на търговската къща. Разтваря се в за предпочитане стерилна дестилирана вода. Не използвайте топлина, за да се разтвори, защото карбамидът е чувствителен към топлина.

Методът на мембранната филтрация се използва за стерилизиране. За тази цел се използва филтър Millipore с пори с диаметър 0,45 μ. Не използвайте автоклав. След като разтворът се филтрира, той се разпределя в стерилни епруветки. За да се получат надеждни резултати, тя трябва да се прехвърли между 1,5 ml като минимално количество до 3 ml като максимално количество за една тръба..

Съхранявайте в хладилник и го съхранявайте.

Ако методът на филтриране не е наличен, средата трябва да се използва незабавно, за да се получат надеждни резултати.

Друг начин да се приготви бульонът Стюарт от урея е както следва:

Някои търговски къщи продават половината база за теста за урея, без да включват карбамид.

Сумата, посочена от търговската къща, се претегля. Разтваря се в дестилирана вода и се стерилизира в автоклав при 121 ° С в продължение на 15 минути. Оставете я малко и когато средата е топла, добавете 100 ml разтвор на карбамид, приготвен при 20% и стерилизиран чрез филтрация.

Той се разпределя в стерилни епруветки, както е описано по-горе.

Бульон или карбамиден агар от Christensen

-Приготвяне на разтвор на карбамид

Претеглят се 29 грама дехидратирана урея и се разтварят в 100 ml дестилирана вода. Използвайте метода на филтриране, за да стерилизирате. Не автоклавирайте.

-Агар на основата на карбамид

Разтварят се 24 g от дехидратирания основен агар в 950 ml дестилирана вода. Стерилизирайте в автоклава при 121 ° С за 15 минути. Оставя се да престои, докато се достигне температура от 50 ° C и се прибавя асептично предварително приготвената урея.

Налейте 4 до 5 ml в стерилни епруветки и наклонете, докато се втвърди. Трябва да има дълъг връх на флейта.

Тази среда може също да бъде приготвена в течна форма.

приложения

Тестът за урея е изключително ефективен за разграничаване на рода Proteus от други родове на семейството Enterobacteriaceae, като се има предвид бързата реакция на Proteus.

Ако се използва съставът на Christensen, тестът помага да се разграничат видовете от един и същи род. Например, S. haemolyticus и S. warneri sза стафилокок коагулаза отрицателна и бетагемолитична, но те се различават по това S. haemolyticus тя е отрицателна урея и S. warneri това е положителна урея.

От друга страна, McNulty успешно е използвал 2% бульон Кристенсен урея за изследване на присъствието на Helicobacter pylori в проби от биопсии, взети от стомашната лигавица (антрална област).

Наличието на H. pylori това се доказва с положителен тест за урея. Продължителността на наблюдение на резултатите е право пропорционална на количеството налични микроорганизми.

Както може да се види, това е прост метод за диагностициране Helicobacter pylori в стомашни биопсии.

И накрая, този тест е полезен и за разграничаване на видовете от родовете Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus и Mycobacteria.

Засяване на теста за урея

Двата метода изискват силен микробен инокулум за оптимизиране на резултатите. Бактериалните колонии за предпочитане се вземат от кръвни агари и Sabouraud агарни дрожди, с някои изключения. Инокулумът се емулгира в течна среда.

За бульон Stuart карбамид, инкубиран при 37 ° С в продължение на 24 до 48 часа, знаейки, че човек търси само щамове от рода Proteus, когато щамът е бактерия. За дрождите може да се инкубира при 37 ° С или при стайна температура за 24 до 48 часа инкубация.

В случай на бульон на Christensen urea, инкубирайте при 37 ° C за 24 часа. Ако тестът е отрицателен, той може да бъде инкубиран до 6 дни. Ако тестът е положителен преди 6 часа, това показва, че той е щам от рода Proteus.

В случая на Christensen уреен агар, агарната фаска е силно инокулирана, без пробождане. Бульонът се инкубира и интерпретира по същия начин.

Контрол на качеството

Контролни щамове могат да се използват за тестване на средата, като например Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 и Salmonella typhimurium.  Първите две трябва да дадат положителни резултати и последните два отрицателни резултата.

препратки

  1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Използване на бульон Стюарт за уреазен тест, като тест за диагностициране на дрожди. Rev. Soc. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Достъпни на: Scielo.org.
  2. Mac Faddin J. (2003). Биохимични тестове за идентификация на бактерии от клинично значение. 3-то изд. Редакция Панамерикана. Буенос Айрес Аржентина.
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld А. (2009). Микробиологична диагноза на Bailey & Scott. 12 изд. Редакция Panamericana S.A. Аржентина.
  4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. 5-то изд. Редакция Panamericana S.A. Аржентина.
  5. Laboratories Britania. Кристенсен Медио (база за урея агар) 2015. Достъпни на: britanialab.com