Характеристики на протеиназа К, ензимна активност и приложения

на протеиназа К е ензим, който принадлежи към групата на серинови протеази, т.е. има в своя активен каталитичен център аминокиселинен серин и има функцията да разкъсва пептидните връзки чрез хидролиза. На свой ред този ензим принадлежи към семейството на протеини субтилизини (пептидаза S8).

Протеиназа К има молекулно тегло (MW) от 28 900 далтона и е изолирана за първи път през 1974 г. от екстракти от гъбички. Албум на Engyodontium, по-рано известен с името на Tritirachium албум Limber.

Той притежава висок протеолитичен капацитет, демонстриращ, че е в състояние да разгражда кератина в косата. Думата кератин на английски е написана "кератин", затова се нарича "протеиназа К".

Поради високия си капацитет за разцепване на природни протеини, този ензим е полезен в различни техники на молекулярна биология. Използва се главно за изолиране и подготовка на нуклеинови киселини с високо молекулно тегло (MW).

Протеиназа К действа чрез освобождаване на ядрената ДНК, докато унищожава протеините и инактивира РНКазите и DN-азите, т.е. елиминира нуклеазите в препаратите на ДНК и РНК..

От друга страна, беше видяно, че протеиназа К може да хидролизира някои денатурирани природни протеини, което е предизвикало интереса на изследователите за неговото използване при изследване на прионови протеини (PrPC)..

Въпреки високата си протеолитична активност обаче има протеини, които са резистентни на действието на протеиназа К. Сред тях има някои анормални протеини, наречени приони (PrPSc), свързани с трансмисивни спонгиформни енцефалопатии..

индекс

• 1 Характеристики на протеиназа К
• 2 Ензимна активност
• 3 Приложения
• 4 Предимства на протеиназа К
• 5 Резистентни към протеина протеини К
• 6 Препратки

Характеристики на протеиназа К

Протеиназа К има третична структура, образувана от три слоя, с β лист от седем вериги, разпръснати между два слоя спирали. Тъй като той принадлежи към семейството на S8 пептидази, той се характеризира с наличието на каталитична триада в неговото активно място, чийто последователен ред е (Asp, His и Ser), което ги отличава от други семейства пептидази..

Този ензим от групата на серинови протеази се характеризира чрез хидролизиране на пептидните връзки близо до карбоксилната група на алифатните и ароматните аминокиселини..

От друга страна, той е в състояние да действа в присъствието на някои корозивни вещества, като натриев додецил сулфат (SDS), Tris-HCL и EDTA, които се използват за подпомагане на денатурацията на протеини, причинявайки ги да загубят своята естествена структура.

Това е предварителна стъпка в приготвянето на протеини за техниката на електрофореза. Диапазонът на рН, при който протеиназа К действа, е доста широка (2,0 до 12,0), с оптимално рН между 7,5 и 12,0 и неговата изоелектрична точка е 8,9. Както може да се наблюдава, той е активен срещу много широк диапазон на рН.

Друга характеристика, която се откроява в протеиназа К е неговата стабилност при наличие на високи температури (50 - 60 ° С).

Ензимна активност

Протеиназа К се нуждае от присъствието на калциев йон, въпреки че това не засяга неговата активност, ако е от съществено значение да се запази нейната стабилност.

За да протеиназата К да извърши пълното разграждане на субстрата, е необходимо приблизително време на контакт между 5 минути и 2 часа..

Въпреки това, в този смисъл Daza et al., Сравнява чистотата на ДНК, получена при няколко пъти експозиция на протеиназа К, и заключи, че продължителната инкубация (до 24 h) значително подобрява качеството на ДНК.

Сега, по отношение на концентрацията, която се използва за ензима протеиназа К в различните протоколи, може да се каже, че тя е много разнообразна..

Може да се използва от много ниски концентрации (5 μg / ml) до концентрации от 500 μg / ml. Но най-често срещаните работни концентрации варират между 50-100 μg / ml, особено за разграждане на протеини и инактивиране на нуклеаза. Въпреки че за лечение на тъкан е необходима концентрация от 2 mg / ml.

приложения

Неговите приложения са много широки и могат да бъдат обобщени в следното:

-Той се използва за разграждане на протеини и екстракция на ДНК чрез няколко метода, като например: осоляване, PK-SDS, цетил-триметил амониев бромид (CTAB), модифициран калиев ацетат и екстракция с натриев йодид..

-Инактивиране на нуклеази (РНКази и ДНКази).

-В хибридизационната техника in situ (HIS), за да помогне за освобождаването на нуклеиновата киселина, в допълнение към елиминирането на нежелани протеини.

-Протеинова модификация.

-На изследователско ниво, в различни изследвания.

Предимства на протеиназа К

Няколко сравнителни проучвания са проведени между техники за екстракция на ДНК, използващи протеиназа К, с други, които не я използват, и всички заключават, че има по-големи ползи при използването на ензима. Сред предимствата могат да се посочат следните:

-Получава се висококачествена и чистота ДНК с високо молекулно тегло.

-Екстрахираната ДНК е стабилна до 3 месеца.

Екстрахираната ДНК може да се използва в следните техники: Southern blot, полимеразна верижна реакция (PCR), електрофореза, между другото.

Протеини, резистентни на протеиназа К

Различни изследвания показват, че prions (анормални PrPSc токсични протеини) се диференцират от PrPC протеини (естествени), защото са резистентни на действието на протеиназа К, докато PrPC са чувствителни към тяхното действие..

Други автори са описали, че в структурата на PrPSc има чувствителни части и други, резистентни към протеиназа К. Въпреки това, двете части са еднакво токсични и инфекциозни..

От друга страна, Bastian и сътрудници през 1987 г. са изолирали 4 протеини от 28, 30, 66 и 76 kda от един вид Spiroplasma mirum. Всички те са резистентни на действието на протеиназа К и също имат кръстосана реакция с някои приони.

Известно е, че този вид може да причини катаракта и важни неврологични увреждания и поради научните открития на Bastian, наред с други изследвания, е направен опит за свързване на този микроорганизъм с трансмисивните спонгиформни енцефалопатии..

Въпреки това, етиологията на тази дегенеративна неврологична патология все още се приписва на прионите днес.

В този смисъл, Бътлър и сътрудници през 1991 г. са идентифицирали и характеризирали клас от 40 Kda протеиназа, устойчива на протеиназа К от два щама на Mycoplasma hyorhinis. Този патоген засяга прасетата, заразявайки техните тъкани, но в този случай не е имало кръстосана реакция с тестваните приони.

Необходими са повече изследвания, за да се изясни много неизвестни за него.

препратки

1. Bastian F, Jennings R и Gardner W. 1987. Антисерумът за скрейпи-свързан фибрилен протеин реагира кръстосано с Spiroplasma mirum фибрилни протеини. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Оценка на метода за извличане и пречистване на ДНК от мускулна тъкан, фиксирана във формалдехид от неидентифицирани трупове.  Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, и Mcgarrity G. Идентифициране и характеризиране на протеиназа K-устойчиви протеини в членовете на клас Mollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Сравнение на два протокола за извличане на ДНК от Trypanosoma cruzi отгледани в аксенова среда. Перу. Med. Exp. Public Health  2014; 31 (2): 222-227. Достъпни на: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E и Palma W. Определяне на ефективността на пет протокола за екстракция на ДНК от парафинов материал за молекулярни изследвания. Rev Méd Univ Коста Рика. 2007; 1 (1): 10-19.