ДНК секвениране Maxam-Gilbert, Sanger метод, примери



на ДНК секвениране (дезоксирибонуклеинова киселина) е процедура, извършвана в лаборатории за молекулярна биология, която позволява да се знае реда на нуклеотидите в генетичния материал, който представлява интерес. В допълнение, секвенирането на РНК (рибонуклеинова киселина) също може да бъде разкрито.

Тази техника е необходима за развитието на биологичните науки. Той е приложим и в други области на знанието, като например медицинска диагноза и съдебномедицински разследвания.

Преди това секвенирането на верига от ДНК се счита за бавна и скъпа активност, което позволява идентифицирането само на няколко основни двойки в олигонуклеотидите.

Днес, с всички постижения на науката, на ДНК е рутинна операция в много лаборатории по целия свят, благодарение на приноса на почти 50 години на изследвания в тази област. Като дължината на веригата, те могат да бъдат разглеждани в последователност на милиони базови двойки в кратък период от време.

За целта са разработени десетки техники, които се различават по цена и точност. В тази статия ще опишем както класическите, така и съвременните техники, всяка със своите предимства и недостатъци.

Досега техниките за секвениране позволяват да се получи последователността от пълни геноми, от малки прокариоти и дрожди до човешкия геном..

индекс

  • 1 Структура на ДНК
  • 2 История
  • 3 Метод Sanger
    • 3.1 Основни компоненти на реакцията
    • 3.2 Четене на резултатите
  • 4 Автоматично подреждане
  • 5 секвениране на Maxam-Gilbert
    • 5.1 Процедура
    • 5.2 Четене на резултатите
  • 6 Масивно секвениране
    • 6.1 Пиросеквениране
    • 6.2 Секвениране чрез синтез
    • 6.3 Последователност чрез лигиране
    • 6.4 Последователност на йонния торент
  • 7 Примери
    • 7.1 Последователност на човешкия геном
  • 8 Значение и приложения
  • 9 Препратки

Структура на ДНК

За да се разберат методите и техниките, използвани за ДНК последователността, е необходимо да се знаят някои ключови аспекти на структурата и състава на молекулата.

ДНК е биомолекула, която се намира във всички живи същества, от бактерии до големи водни животни. Органелите - като митохондриите и хлоропластите - имат кръгова ДНК молекула вътре в тях. Дори при някои вируси, генетичният материал е ДНК.

Структурно ДНК е набор от нуклеотиди. Всеки един е интегриран с въглехидрат, азотна база (А, Т, С или G) и фосфатна група. Целта на ДНК секвенирането е да се разкрие реда, в който се намират четирите азотни бази в последователността.

история

В средата на 50-те години изследователите Уотсън и Крик описват структурата на ДНК, използвайки христологични техники. Въпреки това, никой от тези изследователи не е успял да намери начин да разкрие последователността.

Въпреки че имаше някои предшественици, най-важното събитие бе създаването на метода на Сангър, през 1977 г. Фредерик Сангър, бащата на метода е британски биохимик, носител на две Нобелови награди за техните огромни приноси към биологичните науки.

Тази техника е известна също в литературата като "завършване на веригата" или дидезоксинуклеотиди. След това ще опишем принципите на тази техника и тези, които бяха разработени въз основа на подобрението и иновацията на това.

Методът на Сангер

Развитието на метода на Сангер представлява решаващо събитие в молекулярната биология. Той включва основните компоненти на процеса на репликация на ДНК, които обикновено се случват в клетката, но чрез добавяне на специален компонент: дидеоксинуклеотиди.

Основни компоненти на реакцията

- ДНК полимераза: ДНК полимераза ензим е критичен елементи на процеса. Тази молекула е включена в репликацията на ДНК веригата и неговата роля е синтезата на нов верига, съвпадение с допълнителни деоксирибонуклеотидни трифосфати.

Припомнете си, че ДНК тимин (Т) се чифтосват с аденина (а) до два водородни връзки, докато цитозин (С) прави с гуанин (G) с три мостове.

- Нуклеотидите Sanger секвениране включва два типа нуклеотиди, 2'-деоксинуклеотиди четири (съкратено дАТФ, дГТФ, дТТР и дЦТФ) и четирите дидеоксинуклеотиди (ддАТФ, ddGTP, ddCTP и ddTTP) Специални.

Въпреки че дидезоксинуклеотидите са подобни на мономерите, които обикновено са включени в ДНК, те нямат -ОН група в тяхната структура. Това прави невъзможно добавянето на нов нуклеотид към веригата.

Следователно, когато се добави специален нуклеотид - по напълно случаен начин - към веригата на образуване, синтезът е парализиран. По този начин, в края на реакцията, има вериги с различни размери, всяка от които, където реакцията се спира в различна точка.

Експериментално са изготвени четири опита. Всяка от тях съдържа ДНК, извлечена от интересуващата ви биологична проба, нормалните нуклеотиди и един от четирите вида специални нуклеотиди. Или специалните нуклеотиди са маркирани с някакъв вид флуоресцентен маркер (виж по-долу автоматизирано секвениране).

Четене на резултатите

Първата стъпка е да се раздели всяка от синтезираните вериги според техния размер. Някои ще бъдат по-дълги от други, в зависимост от това къде са включени специалните бази.

Съществуват различни биохимични техники, които позволяват отделянето на компонентите на сместа, като се използва размерът като дискриминационна собственост. При метода Sanger различните вериги се разделят чрез електрофореза. В най-сложните варианти на техниката се използва капилярна електрофореза.

По този начин по-дългите нишки се движат по-малко от по-късите варианти. След това, тази система преминава през четец, който разпознава маркера, включен във всеки дидеоксинуклеотид. По този начин, редът на последователността може да бъде известен.

Тази техника от "първо поколение" може да чете ДНК фрагменти, не по-големи от 1 килобаза. Понастоящем методът на Сангер се използва в няколко лаборатории, най-вече в модерните му варианти. В допълнение, той се използва за потвърждаване на резултатите, получени с най-сложните техники, но по-малко точни.

Автоматично подреждане

Когато е необходимо широкомащабно секвениране, процесът се ускорява чрез автоматизация. Това е вариант на метода на Сенгер, където праймерите са маркирани с флуоресцентни продукти, за да ги разграничат..

Впоследствие продуктът от реакцията се провежда в електрофореза - всичко в една лента. Когато всеки фрагмент напусне крайната част на гела, той бързо се идентифицира чрез флуоресцентния му етикет, с грешка, която заобикаля 1%.

Най-усъвършенстваните системи имат система от до 96 капилярни тръби, управлявани от компютър, свързан с робот. Това означава, че 96 ДНК проби могат да бъдат оценени едновременно. По този начин процесът, включващ електрофореза и анализът на резултатите, е напълно автоматизиран.

В един ден тези системи могат да подредят до 550 000 бази. По време на процеса, човешката работа е ненужна, отнема само около 15 минути за започване на метода.

Последователност от Максим-Гилбърт

В същото време, когато Sanger публикува своята работа, двама изследователи на име Allan Maxan и Walter Gilbert успяват да разработят друг метод за получаване на ДНК последователността. Методът придоби популярност по това време, но по-късно бе изместен от подобряването на метода на Сангер.

Противно на метода на Сангер, последователността на Maxan и Gilbert (или химическото секвениране, както е известно) не включва хибридизационни реакции. Методологията се състои в маркиране с реактивни агенти в единия край, последвано от процес на пречистване.

Един от негативните аспекти на тази техника се крие в неговата огромна сложност и в използването на химикали, които са опасни за потребителя. Химичните разграждания се предизвикват от прилагането на DMS, мравчена киселина, хидразин и хидразин със соли.

процес

Протоколът започва с етикетирането в 5 'края на нишката с фосфорен маркер 32, след което се получава химическа модификация на азотната основа и тя се разделя. Накрая се случва разцепването на абазистния участък.

Първо веригата, която трябва да бъде секвенирана, се скъсява на по-малки сегменти. Тази стъпка се извършва с рестрикционни ензими, които водят до изключителни крайности.

След това реакцията се провежда с алкална фосфатаза, чиято цел е да елиминира фосфатната група. По този начин може да се използва полинуклеотидна киназа за извършване на маркирането.

Веригата е денатурирана (двете отворени вериги). След това продължаваме да прилагаме химикалите. Тези реакции на разцепване се извършват по контролиран начин и какви видове връзки се разрушават от всяко приложено химично вещество.

Четене на резултатите

Както при метода на Сенгер, отчитането на резултатите включва разделяне по размер на веригите, получени в електрофорезна система. Системите, съставени от полиакриламид, позволяват да се получи много адекватна резолюция за отчитане на гела.

Масивно секвениране

Мащабното секвениране обхваща поредица от нови методи, съкратени като NGS, от английски "Секвенция от следващо поколение ".

Методите, каталогизирани като NGS, изискват предишна стъпка на ДНК амплификация (те не работят с една молекула). Освен това използваните платформи варират в широки граници. Принципите на най-популярните методи ще бъдат описани по-долу:

пиросеквениране

Той включва мониторинг на освобождаването на пирофосфат, който се появява всеки път, когато към ДНК веригата се добавя нов нуклеотид. Една ензимна система е свързана, така че излъчването на светлина (което се открива от камерата) се появява всеки път, когато се включи нов нуклеотид..

Процесът започва с отделно инкубиране на всяка азотна основа, за да се провери дали има излъчване на светлина или не. Пиросеквенирането може да извърши отчитането на дългите нишки, но намереният процент на грешки е висок.

Секвениране чрез синтез

Това включва включването на белязани нуклеотиди. Тези флуоресцентни компоненти се добавят, промиват и се отбелязва включеният нуклеотид. След това, нуклеотидният белег се елиминира и синтезът на веригата може да продължи. В следващия етап също ще бъде включен маркиран нуклеотид и споменатите стъпки ще бъдат повторени.

Един недостатък при тази техника се случва, когато флуоресцентните маркери не са напълно елиминирани. Тези емисии създават фонови грешки, водещи до значителни грешки.

Последователност чрез лигиране

Тази техника варира от другите, тъй като не използва ДНК полимераза. Вместо това, ключовият ензим за тази методология е лигаза. Тук се използват ДНК фрагменти, флуоресцентно белязани, е свързана с ензима и се открива.

Най-големият проблем с тази техника е много късата дължина на фрагмента, който е способен да обработи.

Йонна секвенция на торент

Тази техника се основава на измерването на Н-йона+ който се освобождава всеки път, когато се включи нов нуклеотид. Принципът е доста сходен с пиросеквенирането, но много по-евтино.

Примери

Последователността на човешкия геном

Последователността на генома на хората е едно от най-обещаващите предизвикателства в биологията, както и едно от най-известните съперничества в историята на науката. Всъщност, за учените, участващи в проекта, последователността на генома стана конкуренция.

През 1990 г. той започва да се нарича „проект за човешки геном”, воден от известния учен, носител на Нобелова награда Джеймс Уотсън. След една година, през 1991 г., Вентър поема предизвикателството да „бие” Уотсън и да подрежда генома преди него. През 1992 г. обаче Уотсън се оттегля и командването му се поема от друг изследовател.

През 1995 г. Venter обяви успеха си в пълното секвениране на бактериален геном по метода на случайното подреждане. По същия начин противоположният екип обяви година по-късно последователността на генома на дрождите.

През 2000 г. състезанието е прекратено. Двете компании публикуват предварителните си резултати от пълния геном в две от най-престижните научни списания: природа и наука.

Въпреки това, учените продължават да работят за подобряване на предложенията, а през 2006 г. последователностите са завършени някои човешки хромозоми.

Значение и приложения

Познаването на последователността на нуклеотидите на една молекула толкова важно, колкото и ДНК, е ценно за биолози и свързани специалисти. Тази верига от полинуклеотиди съдържа цялата информация, необходима за развитието и поддържането на всички форми на живот.

Поради тези причини, познаването на тази последователност е от съществено значение за биологичните изследвания. По принцип, последователността ни позволява да измерим едно от най-важните свойства на биологичните системи и да установим разлики между тях.

Секвенирането е широко използвано от таксономи и систематисти, тъй като някои ДНК последователности позволяват да се установят критерии за заключение дали два организма принадлежат към един и същи вид или не, както и да могат да предложат хипотези за филогенетичните връзки между тях..

В допълнение, ДНК секвенирането има приложения в областта на медицината и диагностиката. Например, съществуват достъпни и достъпни системи, които чрез последователност ни позволяват да оценим тенденцията за развитие на някои заболявания (като рак), използвайки така наречените прости нуклеотидни полиморфизми (SNP)..

Разследванията от криминалистичен и криминалистичен тип също са обогатени с техниките на секвениране и могат да бъдат използвани като надеждни доказателства за участието на дадено лице в престъпление..

препратки

  1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Последователността на секвенсорите: историята на секвениране на ДНК. геномика, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Следващото поколение революция в последователността и нейното въздействие върху геномиката. клетка, 155(1), 27-38.
  3. Levy, J. (2010). Научно съперничество. От Галилео до проекта за човешкия геном. Paraninfo Editorial.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A.R. (1977). ДНК секвениране с верижно-завършващи инхибитори. Известия на Националната академия на науките, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, С. C. (2007). Последователността от следващо поколение трансформира днешната биология. Природни методи, 5(1), 16.
  6. Xu, J. (Ed.). (2014). Последователност от следващо поколение. Кайстър Академик Прес.