Основа, подготовка и употреба на теста Voges-Proskauer



на Тест на Voges-Proskauer е биохимичен тест, който се използва за идентифициране на бактерии, принадлежащи към семейството Enterobacteriaceae. Особено е полезно да се разграничат щамовете на Escherichia coli от Klebsiella и Enterobacter, между другото.

Тестът се провежда в течна културална среда, наречена метил червено-Voges Proskauer, по-известна с акронима RM / VP. Тази среда се състои от буфериран полипептон, глюкоза, дикалиев фосфат и дестилирана вода.

Настоящата RM / VP среда е модификация на Clark и Lubs средата, която първоначално съдържа по-ниска концентрация на пептони и глюкоза. Затова се получава по-малко водороден йон, необходим за положителната реакция на Voges-Proskauer.

Тестът се основава на способността на микроорганизма да използва глюкоза чрез пътя на бутилен гликол и да образува неутрален краен продукт, наречен ацетоин, в присъствието на кислород и алкално рН..

В средата RM / VP, освен че може да разкрие теста Voges-Proskauer, тестът с метилово червено също може да бъде разкрит.

индекс

  • 1 Фондация
    • 1.1 Основа на теста Voges-Proskauer
    • 1.2 Основа за разработване на теста и интерпретация
  • 2 Подготовка
    • 2.1 Средно RM / VP
    • 2.2 Voges A Reagent
    • 2.3 Реагент на Voges B
  • 3 Процедура на теста Voges-Proskauer
    • 3.1 Разработване на теста
  • 4 Използване
  • 5 Контрол на качеството
  • 6 Препратки

фундамент

Основа на теста Voges-Proskauer

Плурипептоните, присъстващи в средата, осигуряват хранителните изисквания, необходими за бактериалния растеж. От своя страна глюкозата е основното съединение. Много бактерии имат способността да метаболизират глюкозата и да образуват пирувинова киселина.

Пирувиковата киселина е средна точка в метаболизма на глюкозата и от там всеки микроорганизъм може да поеме по различни пътища. Някои ще образуват смесени киселини, като млечна киселина, оцетна киселина, мравчена киселина и янтарна киселина, а други ще образуват неутрални продукти като 2,3-бутандиол..

Тестът Voges-Proskauer показва способността на микроорганизма да образува ацетил метил карбинол (ацетоин), междинен продукт на 2,3-бутандиол при аеробни условия.

Ацетоинът се редуцира и образува 2,3-бутандиол, но тази реакция е обратима, така че ако 2,3-бутандиол се окисли, се образува ацетоин. Следователно, кислородът е от съществено значение.

Дикалиев фосфат е буферът, който погасява сместа при рН 6,9 ± 0,2..

Основа за разработване на теста и интерпретация

За да се демонстрира реакцията, трябва да се извърши разработка с помощта на два реагента (реактиви на Barrit), известни като Voges A и Voges B.

Voges A е 5% разтвор на α-нафтол, а Voges B е 40% препарат от калиев хидроксид. Ако няма калиев хидроксид, той може да бъде заменен с 40% натриев хидроксид.

А-нафтолът е катализатор, който увеличава интензивността на цвета на реакцията, което прави теста по-чувствителен. А-нафтолът трябва винаги да се добавя първо, като се разбърква тръбата, така че средата да влезе в контакт с кислород. По този начин присъстващият ацетоин се окислява до диацетил и 2,3-бутандиолът се окислява до образуване на ацетоин, като се предава на диацетил..

По този начин α-нафтолът ще се свърже с диацетил, който от своя страна е свързан с гуанидиновото ядро, присъстващо в аминокиселината аргинин, като последното идва от плурипептона..

От своя страна калиев или натриев хидроксид е отговорен за абсорбирането на СО2 и реагират с пептоните. Тази реакция предизвиква образуването на розово-сьомгова окраска, която се вижда ясно след разклащане на тръбата много добре.

За да се получи оцветяване незабавно, трябва да се смесят правилните количества диацетил, пептон и а-нафтол. Ако това не се случи, оставете тръбата да остане за 15 минути преди интерпретацията.

Обикновено тестът е положителен след 2 до 5 минути, когато може да се наблюдава слаб розов цвят. Ако остане в покой за 30 мин. До 1 час, интензивността на цвета ще бъде максимална (тъмночервена).

Отрицателен тест ще бъде очевиден, когато бульонът е жълт. След 1 час, ако тестът е отрицателен, може да се образува меден цвят в резултат на реакцията на калиев хидроксид върху α-нафтол.

подготовка

Среден RM / VP

Претеглят се 17 g от дехидратираната културална среда и се разтварят в един литър дестилирана вода. Оставете да престои 5 минути. Загрява се до кипене, за да се разтвори напълно. Сервирайте 3 до 4 ml в епруветки и стерилизирайте в автоклав при 121 ° С за 15 минути.

Дехидратираната хранителна среда е бежова и подготвената среда е светло кехлибарена.

Крайното рН на средата е 6.9 ± 0.2.

Voges A Reagent

Претеглят се 5 g α-нафтол и се разтварят в 50 ml етилов алкохол (абсолютно). След това продължете добавянето на етилов алкохол до 100 ml.

Реагент Voges B

Претеглят се 40 g калиев хидроксид и се разтварят в 50 ml дестилирана вода в бехерова чаша. Стъклото трябва да се постави в студена водна баня, за да се контролира температурата, тъй като по време на разтварянето препаратът рязко се повишава.

След като разтворът се охлади, той се прехвърля в градуиран балон и се довежда до 100 mL с дестилирана вода.

Процедура на теста Voges-Proskauer

За провеждане на теста на Voges-Proskauer, RM / VP бульон се инокулира с изследваната микроорганизма, от чиста култура от 18 до 24 часа.

Инокулумът не трябва да бъде прекалено гъст. Инкубира се при 35-37 ° С в продължение на 24 до 48 часа, въпреки че понякога инкубацията е необходима за няколко дни. Cowan и Steel смятат, че 5 дни е минималното инкубационно време, необходимо за откриване на всички положителни видове Voges-Proskauer (VP) от семейството Enterobacteriaceae.

Разработване на теста

Отделете аликвота от 1 ml в епруветка и извършете разработването по следния начин: поставете 12 капки (0.6 mL) от Voges A реагент и 4 капки (0.2 mL) от Voges B. Разбъркайте, за да аерират и оставете за 5 - 10 минути преди изпълнение. Въпреки това, ако тестът все още е отрицателен, оставете го да престои и наблюдавайте тръбата след 30 минути до 1 час.

Появата на розово-червен цвят показва, че реакцията на Voges-Proskauer е положителна. Ако средата остане жълта, реакцията е отрицателна.

Добавянето на разработчиците в посочения ред и количество е от съществено значение, за да се избегнат фалшиви негативи.

употреба

Тестът Voges-Proskauer е полезен за разграничаване между щамовете на Е. coli които са VP отрицателни, на родовете Klebsiella, Enterobacter, Serratia, наред с други, които са позитивни.

Контрол на качеството

Контролни щамове могат да бъдат използвани за тестване на качеството на приготвената среда. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium и Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Очакваните резултати са само положителни реакции на Voges-Proskauer K. pneumoniae и E. cloacae. Останалите дават отрицателни реакции.

препратки

  1. Laboratories Britania. MR-VP среда. 2015. Налично на: www.britanialab.com
  2. Microkit Laboratories M-Ident Voges Proskauer. 2014. Налични: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Биохимични тестове за идентификация на бактерии от клинично значение. 3-то изд. Редакция Панамерикана. Буенос Айрес Аржентина.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld А. (2009). Микробиологична диагноза на Bailey & Scott. 12 изд. Редакция Panamericana S.A. Аржентина.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. 5-то изд. Редакция Panamericana S.A. Аржентина.