Агарът има стандартна основа, подготовка и употреба



на стандартен агар е твърда, неселективна културална среда, предназначена за количествено определяне на аеробното микробно натоварване, присъстващо в проби от питейна вода, отпадъчни води, млечни напитки, наред с други храни. Тази среда е известна също като PCA агар, заради съкращението му в английския агар за графика на плочите. Създадена е през 1953 г. от Buchbinder, Baris и Goldstein.

Стандартната сметка на агаровата среда е съставена от дрождев екстракт, трипин, глюкоза, агар и дестилирана вода. Тази формулировка съдържа основни хранителни елементи, които позволяват развитието на настоящия аеробен микробен товар, не изискващ.

Тъй като средата не съдържа инхибитори, бактериите могат да се развиват без никакви ограничения, така че е идеална за общ брой колонии. Въпреки това, техниката за количествено определяне на плочки няма да открие всички присъстващи бактерии, а само тези, които са способни да растат при условията на околната среда, на които е подложен стандартният посевен агар..

В този смисъл, техниката за количествено определяне на плочите цели да определи като цяло количеството на аеробните бактерии от мезофилен тип, т.е. тези, които се развиват при температури между 25 и 40 ° С, с оптимална температура на растеж при 37 ° С..

Тази бактериална група е много важна, тъй като повечето от патогенните бактерии за човека.

Трябва да се отбележи, че понякога може да е интересно да се определи количеството на психотрофилните бактерии, присъстващи в храната. Тези бактерии се развиват при ниски температури (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

По подобен начин термофилните бактерии, които се развиват в диапазона от 50 ° С до 80 ° С или повече, могат да бъдат важни за някои видове храни, като консерви..

Микробното количествено изражение се изразява в единици, образуващи колония (CFU) на грам или милилитър от пробата.

индекс

  • 1 Фондация
  • 2 Подготовка
    • 2.1
    • 2.2 За засаждане на повърхността
  • 3 Използвайте
    • 3.1 Техника за изливане на плоча (засята с дълбочина)
    • 3.2 Техника, засета на повърхността
  • 4 Контрол на качеството
  • 5 Ограничения
  • 6 Препратки

фундамент

Стандартната среда за броене е проектирана така, че да позволява задоволително развитие на неефективни аеробни бактерии, тъй като екстрактът от дрожди, тригеинът и глюкозата осигуряват необходимите хранителни вещества за доброто микробно развитие..

От друга страна, средата има ясен цвят и прозрачен външен вид, поради което е идеална за показване на колониите, разработени по метода на дълбоката сеитба (изливане в плоча)..

Също така е възможно да се преброят колониите по метода на сеитба на повърхността с шпатула на Дригалски.

Когато микробният товар е висок, трябва да се правят десетични разреждания на изследваната проба, за да се преброят CFUs.

Трябва да се отбележи, че тази среда се препоръчва от Американската асоциация за обществено здраве (APHA) за преброяване на аеробни мезофили.

подготовка

Претеглят се 23,5 g дехидратирана среда и се разтварят в един литър дестилирана вода. За да се разтвори напълно, сместа трябва да се нагрява често до кипене. Под-следващите стъпки зависят от техниката на засяване, която ще се използва.

За техниката на изливане на чинии

Разпределете чрез разпределяне на 12 до 15 ml в епруветки. След това се стерилизира в автоклав при 121 ° С в продължение на 15 минути. Оставя се да се втвърди вертикално под формата на блок. Да се ​​съхранява в хладилник до употреба.

Разтопете репликата, когато ще бъде използвана. След като се стопи, се съхранява на водна баня при 44-47 ° C, докато се приготвят проби.

За засаждане на повърхността

Стерилизирайте средата в автоклав при 121 ° С и след това разпределете 20 ml в стерилни петриеви блюда. Оставете да се втвърди, обърнете и съхранявайте в хладилник до употреба.

Натопете плаките преди употреба. РН на средата трябва да бъде 7,0 ± 0,2.

употреба

Броят на агаровия стандарт се използва при техниката на аеробно мезофилно преброяване по време на микробиологичния анализ на вода и храна. Преброяването на аеробни мезофили е необходимо, тъй като определя санитарното качество на изследваната проба.

Прилагането на тази техника (използвайки тази среда) позволява макроскопска визуализация на изолирани колонии за тяхното количествено определяне.

Техника за изливане на плаки (засята с дълбочина)

-процес

Техниката се състои от следното:

1) Хомогенизирайте пробата, за да преразпределите наличните бактерии.

2) Първоначална суспензия се провежда в стерилен флакон или торба, като се спазва съотношението 10 g или 10 ml проба в 90 ml разредител (10-1).

3) От първоначалното спиране се правят съответните десетични разреждания в зависимост от вида на пробата. Пример: (10-2, 10-3, 10-4). Разрежданията се правят с пептонова вода или фосфатен буфер.

За да направите това, вземете 1 ml от първоначалната суспензия и поставете в 9 ml разредител, продължете разрежданията, ако е необходимо, като вземете 1 ml от разреждането.-2 и така нататък.

4) Вземете по 1 ml от всяко разреждане и поставете в празни стерилни петриеви блюда.

5) Към всяка плака се добавят 12 до 15 ml стандартен брой агар, предварително разтопен и настроен на 44 - 47 ° С.

6) Осигурете плавни въртеливи движения към плочите, за да разпределите пробата в агара равномерно и да се остави да се втвърди.

7) Обърнете плаките и инкубирайте при 37 ° С в аеробиоза за 24 до 48 часа.

8) След като завърши времето, продължете с изследването на плочите и пребройте колониите в разреждането, което го позволява. Той е избран за преброяване на плочите, които имат между 30 и 300 CFU.

Преброяването може да се извърши ръчно или може да се използва оборудване на брояча на колониите.

Допустимите стойности за 1 ml от пробата могат да варират в различните държави в съответствие със стандартите, по които те се регулират.

-Изчисляване на UFC

Общото изчисление се прави по следната формула:

Резултатите се изразяват с 1 или 2 цифри, умножавайки се с подходящата база 10. Пример: ако резултатът е 16.545, той се закръглява въз основа на третата цифра до 17.000 и се изразява, както следва: 1.7 x 104. Сега, ако резултатът е 16,436, се закръглява до 16 000 и се изразява 1,6 х 104.

Техника, засадена на повърхността

-процес

-Инокулирайте с 0,1 ml пряка проба, ако е течна, първоначална суспензия 10-1 или на последователни разреждания 10-2, 10-3 и т.н., в средата на стандартна агарна плоча.

-Разпределете пробата равномерно с лопатка Drigalski или L-образна стъклена пръчка.

-Обратните плаки се инкубират в аеробиоза при 37 ° С в продължение на 24 до 48 часа.

-Продължете да преброите колониите, изберете тези плочи, които са в диапазона между 20 - 250 CFU.

-Изчисляване на UFC

За изчислението се прилага коефициентът на разреждане, който е обратен. Номерът се закръглява до 2 значими цифри (закръгляване според третата цифра) и се изразява в мощност на база 10. Например, ако 224 CFU се броят в пробата без разреждане (10-1), Се отчита 22 х 101  UFC, но ако цифрата е 225, се отчита 23 х 101 UFC.

Сега, ако броите 199 CFU в разреждане 10-3, 20 x 10 ще бъдат докладвани4 UFC, но ако се броят 153 CFU в едно и също разреждане, ще се докладва 15 x 104 UFC.

Контрол на качеството

Стандартната културна среда за броене може да бъде оценена с помощта на известни сертифицирани щамове, като: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Ако културалната среда е в оптимални условия, се очаква задоволителен растеж във всички случаи, с изключение на L. fermentum които могат да имат редовно изпълнение.

За да се оцени стерилността на културалната среда, една или две плаки от всяка приготвена партида (неинокулирана) трябва да се инкубират при 37 ° С в аеробиоза в продължение на 24 часа. В края на този период не трябва да се наблюдава растеж или промяна на цвета на средата..

ограничения

-Не разтапяйте агара повече от веднъж.

-Приготвената среда може да продължи до 3 месеца, докато се съхранява в хладилник и е защитена от светлина.

-Тази среда не е подходяща за взискателни микроорганизми, нито за анаероби.

препратки

  1. Национална администрация по лекарствата, храните и медицинските технологии (ANMAT). Микробиологичен анализ на храната, официална аналитична методология, индикаторни микроорганизми. 2014 Том 3. Достъпни на адрес: anmat.gov.ar
  2. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories, S.A. Агар за брояч на плочи. 2009. Налично на: http://f-soria.es
  3. Лаборатории Конда Пронадиса. Агар за стандартни методи (PCA) съгласно APHA и ISO 4833. Достъпни на адрес: condalab.com
  4. Laboratories Britania. Преброяване върху агарова плоча. 2015. Налично на: britanialab.com
  5. Камачо А, Джайлс М, Ортегон А, Палао М, Серано Б и Веласкес О. 2009. Техники за микробиологичен анализ на храни. 2nd ed. Химически факултет, UNAM. Мексико. Предлага се на адрес: depa.fquim.unam