Основа, подготовка и употреба на агар М.Р.



на агар M.R.S. е селективна твърда хранителна среда, използвана за изолиране и преброяване на млечнокисели бактерии, особено на рода Lactobacillus. Този агар е създаден през 1960 г. от Man, Rogosa и Sharpe, средният носител е със същото име, но поради сложността му често се използва съкращението M.R.S..

Състои се от протеозен пептон, екстракт от месо, екстракт от дрожди, глюкоза, сорбитан монолеат, дикалиев фосфат, натриев ацетат, амониев цитрат, магнезиев сулфат, манганов сулфат и агар..

Този състав позволява правилното развитие на млечнокисели бактерии от клинични проби, като фекалии, вагинален секрет, орални проби и майчино мляко, както и млечни и месни храни..

Не се използва рутинно в клинични лаборатории, тъй като млечнокиселите бактерии рядко участват в патологични процеси. Обаче, използването на M.R.S агар е по-често в областта на хранителната микробиология..

От друга страна, тази среда се използва от някои изследователски центрове, чиято цел е изследване на млечнокисели бактерии.

индекс

  • 1 Фондация
  • 2 Подготовка
  • 3 Използване
    • 3.1 Характеристики на колониите
    • 3.2 Изолиране на млечнокисели бактерии
    • 3.3 Преброяване на млечнокиселите бактерии
    • 3.4 На ниво изследвания
  • 4 Контрол на качеството
  • 5 Препратки

фундамент

Агар Човекът, Рогоша и Шарп имат доста сложен състав. Чрез разрушаване на функцията, която изпълнява всеки от неговите компоненти, може да се обясни неговата основа.

Протеозният пептон, екстрактът от месо, екстракт от мая и глюкоза са хранителни вещества, които осигуряват източника на въглерод, азот, витамини и минерали, необходими за растежа на бактериите. В допълнение, глюкозата е универсален източник на енергия, използван в повечето културални среди.

От друга страна, за да се благоприятства растежа на млечнокиселите бактерии, е необходимо присъствието на незаменими кофактори (катиони) в метаболизма на Lactobacillus и свързаните с тях бактерии; Тези съединения са натриеви, магнезиеви и манганови соли.

Също така, сорбитан монолеат или полисорбат 80 са източник на важни мастни киселини, когато се абсорбират като хранителни вещества.

В допълнение, сорбитан монолеат и амониев цитрат действат чрез инхибиране на развитието на съпътстващата флора, особено грам-отрицателните бактерии, осигуряващи селективния характер на този агар..

Накрая, агар-агар е това, което придава твърда консистенция на средата.

Съществуват и други варианти на агара Man Rogosa Sharpe; един от тях е добавеният с цистеин (M.R.S.c), много полезен за изолиране на бифидобактерии, сред други микроорганизми. От друга страна, има MRS среда допълнена с неомицин, паромомицин, налидиксова киселина и литиев хлорид, особено за селективно преброяване на бифидобактериите в млечните продукти..

подготовка

Претеглят се 68,25 g от дехидратираната среда и се разтварят в един литър дестилирана вода. Оставете да престои 5 минути. За да се разтвори изцяло, довеждайте до топлинен източник, като разбърквате често и оставете да ври в продължение на 1 до 2 минути. Стерилизира се в автоклав при 121 ° С в продължение на 15 минути.

Когато излизате от автоклава, оставете няколко минути и разпределете все още горещо в стерилни петриеви блюда.

Оставете да се втвърди и обърнете плаките, поръчайте плакери и ги съхранявайте в хладилника до употреба. Оставете плочите да приемат стайна температура, преди да ги използвате.

РН на средата трябва да бъде 6.4 ± 0.2. Някои търговски къщи препоръчват рН от 5,5 до 5,9.

Дехидратираната среда е бежова и приготвена е тъмно кехлибар.

Както дехидратираната среда, така и подготвените плаки трябва да се съхраняват при 2 до 8 ° С.

приложения

Агаровите плаки M.R.S. те могат да бъдат засети на повърхността (изтощение или с шпатула на Дригалски). Тя може да се сее и по дълбочина. Плаките трябва да бъдат инкубирани при 37 ° С в микроаерофилни (4% О2 и 5-10% СО2) за 24 до 72 часа.

Методът на засяване се избира в съответствие с преследваната цел (изолация или преброяване).

Характеристики на колониите

Предполагаемите колонии на Lactobacillus растат белезникави и имат мукоиден или кремав вид на този агар. Тогава те трябва да се идентифицират.

Изолиране на млечнокисели бактерии

За целта се използва засаждане по повърхността. Пробите за засаждане изискват предходна процедура. 

В случай на проби от кърмата се препоръчва центрофугиране на 1 ml от пробата при 14,000 rmp в продължение на 10 минути, за да се отстрани мастния слой. 900 μl се изхвърлят и в останалите 100 μl утайката се суспендира и се излива върху M.R.S. След това трябва да се разпредели равномерно с шпатула на Дригалски.

В случай на проби от изпражнения, един (1) грам фекалии се претегля и хомогенизира в 9 mL 0,1% стерилна пептонирана вода, съответстваща на разреждане 1/10. След това се правят серийни разреждания, докато се получи окончателно разреждане 10-4.

Накрая се вземат 100 μl от разрежданията 10-2, 10-3 и 10-4 и всяко разреждане се посява върху MRS агар, разпределяйки равномерно с Drigalski шпатула.

Преброяване на млечнокиселите бактерии

В този случай сеитбата се извършва по дълбочина.

За проби от кърмата вземете 1 mL и го поставете в стерилна конична пластмасова тръба. MRS агар се добавя при температура приблизително 40 ° С до краен обем от 25 ml, при което се получава хомогенна смес. След това се излива в стерилни петриеви панички по еднакъв начин и се оставя да стои, докато се полимеризира..

Разрежданията се правят за проби от изпражнения, както е описано по-горе. Вземете по 1 mL от всяко разреждане и поставете в стерилни конични пластмасови тръби. Добавя се стопен MRS агар до обем от 25 mL.

Сместа от всяко разреждане се излива равномерно в стерилни петриеви панички. Накрая се оставя да стои до полимеризацията му.

На ниво изследвания

Всеки ден изследването на млечнокиселите бактерии става по-интересно; особено изследователите се стремят да познават нови щамове и техния потенциал като иницииращи ферменти за стандартизация при производството на млечни продукти, наред с други употреби.

В този смисъл, Alvarado et al. (2007) използваха агара на M.R.S. да извърши проучване, в което те изолират, идентифицират и характеризират млечнокисели бактерии, присъстващи в занаятчийски пушено сирене във Венецуела.

В сиренето те открили наличието на бактерии от родовете Lactococcus и Lactobacillus и стигнали до заключението, че смесите от изолирани щамове са подходящи като стартерни щамове при производството на сирена от пастьоризирано мляко..

От друга страна, Sánchez et al. (2017) използван M.R.S агар. да изследва наличието на млечнокисели бактерии в храносмилателния тракт на прасенца, за да ги използва като естествени пробиотици, които увеличават продуктивността на здрави прасенца.

С тази среда те успяха да изолират четири вида: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae и Pediococcus pentosaceus.

По същия начин, Báez et al. (2019) използван M.R.S. агар. за оценка на млечнокиселите бактерии (BAL) и бифидобактериите с пробиотичен потенциал в кърмата и изпражненията на кърмачетата.

Те успяха да изолират 11 BAL и 3 Bifidobacteria sp в кърмата и 8 BAL и 2 Bifidobacteria sp. в изпражненията Всички отговарят на определени параметри, които ги акредитират като бактерии с пробиотична дейност.

Авторите стигат до заключението, че както кърмата, така и изпражненията на изключително кърмените бебета служат като естествени източници на пробиотични бактерии.

Контрол на качеството

За оценка на качеството на M.R.S. контролни щамове могат да се използват като:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei АТСС 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli и Bacillus cereus.

Очакваните резултати са задоволителен растеж за първите 6 бактерии, докато Е. coli и Bacillus cereus трябва да бъде инхибиран в своята цялост.

препратки

  1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Изолиране, идентифициране и характеризиране на млечнокиселите бактерии от ръчно изработено венецуелско сирене от Анд. Използването му като начално култивиране. Са-. (Маракайбо) 2007 г .; 17 (3): 301-308. Достъпни на: scielo.org.
  2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro изолация на млечнокисели бактерии от храносмилателния тракт на Прасчо. Rev. ветеринар. Перу 2017; 28 (3): 730-736. Достъпни на: scielo.org.
  3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Оценка на млечнокиселите бактерии и бифидобактерии с пробиотичен потенциал в майчиното мляко и изпражненията на кърмачетата в община Acevedo, Miranda 2017. Бакалавърска работа за придобиване на бакалавърска степен по биологични проучвания. Университет в Карабобо, Венецуела.
  4. Британска лаборатория M.R.S агар. 2015. Налично на: britanialab.com
  5. Уикипедия. MRS агар Уикипедия, Свободната енциклопедия. 10 януари, 2018, 19:44 UTC. Достъпен на: wikipedia.org Достъп 17 февруари, 2019.
  6. Roy D. Медии за изолиране и изброяване на бифидобактерии в млечни продукти. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.