Основаване, подготовка и употреба на Agar Müeller Hinton

на Агар от Müeller Hinton Това е твърда, неселективна хранителна среда, която се състои от инфузия на месо, пептон казеинова киселина, нишесте, агар и дестилирана вода. Тази среда позволява отлично микробно развитие на най-бързо растящите бактерии.

Първоначално той е бил създаден от Джон Хауърд Мюлер и Джейн Хинтън, за да изолират бактериите, които изискват хранителни добавки Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis. Въпреки това, поради неговите характеристики се оказа, че е идеален за изследване на чувствителността към антибиотици, като осигурява надеждни и възпроизводими резултати.

Поради тази причина агарът Müeller Hinton е културалната среда, приета от Института за клинични и лабораторни стандарти (CLSI) и Европейския комитет за изпитване на антимикробната чувствителност, за провеждане на теста за антимикробна чувствителност по дифузния метод на Кирби. Бауер.

индекс

• 1 Фондация
• 2 Подготовка
• 3 Използване
  • 3.1 Антимикробна техника
  • 3.2 Стратегическо поставяне на дискове на агар Мюлер
• 4 Причини за грешни резултати
• 5 Ограничение
• 6 Контрол на качеството
• 7 Препратки

фундамент

Тъй като е неселективна хранителна среда, тя е отлична за растежа на повечето патогенни бактерии.

От друга страна, простият му състав прави веществата лесно дифундиращи се върху него, което е съществена характеристика за теста за чувствителност чрез дисковия дифузионен метод..

Друга от неговите характеристики е, че съдържа малко количество инхибитори, което позволява ефективна оценка на сулфонамидите, триметопримите и тетрациклините..

Трябва обаче да се има предвид, че носителят трябва да отговаря на определени условия, за да се гарантира правилното му функциониране, включително:

Регулиране на рН, дълбочина на агара и адекватна концентрация на тимин, тимидин, Са⁺⁺, мг⁺⁺ и Zn⁺⁺.

Трябва също да знаем, че методологията е стандартизирана и следователно всички параметри трябва да бъдат изпълнени, като например:

Концентрацията на инокулума, концентрацията и запазването на антибиотичните дискове, поставянето на подходящия брой дискове върху агара, разстоянието между един диск и друг, стратегическото поставяне на някои антибиотици, атмосферата, температурата и времето на инкубация.

подготовка

Претеглят се 37 g от дехидратираната среда на Müeller Hinton и се разтварят в 1 литър дестилирана вода. Загрявайте средата, докато разбърквате, за да я разтворите. Оставете да ври в продължение на 1 минута.

Вземете автоклава за стерилизация при 121 ° С за 15 минути. Когато се изважда от автоклава, фиола трябва да се постави на водна баня при 50 ° С, за да се охлади. Налейте 25 до 30 ml в стерилни петриеви панички с диаметър 10 cm.

Плочите трябва да са средна дебелина от 4 мм (идеална), с допустим диапазон от 3-5 мм.

Ако се желае да се приготви кръвен агар с помощта на агарова основа на Müeller Hinton, 5% стерилна и дефибринирана агнешка кръв се излива преди сервиране на плочите..

Крайното рН на средата трябва да бъде между 7.2 до 7.4.

Инвестирайте и съхранявайте в хладилник до употреба. Оставете плочата да се използва при стайна температура.

Цветът на приготвената среда е светло бежово.

приложения

Той се използва за извършване на теста за антибиограма или антибиотична чувствителност към повечето бързорастящи патогени.

Ако агарът е допълнен с кръв, той служи за извършване на антибиограма на взискателни микроорганизми като: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, между другото. Използва се и за изолиране Legionella pneumophila.

Техника на антибиограма

Преди да се приложи антибиограмата, трябва да се приготви бактериален разтвор, еквивалентен на 1,5 х 10⁸ клетка.

За да се направи това, 3 до 4 колонии се вземат от чистата култура и се суспендират в трифтаза соев бульон или в бульон на Müeller Hinton, инкубират се в продължение на 2 до 6 часа и концентрацията се регулира със стерилен физиологичен разтвор, като се сравнява с Mac Farland стандарт. 0.5%.

Ако те са взискателни микроорганизми, колониите могат да бъдат суспендирани директно, докато достигнат концентрация от 0.5% от Mac Farland. След това плочката на Müeller Hinton се засява с тампон, напоен с приготвения бактериален разтвор.

За да направите това, натопете тампона в разтвора и след това извадете излишната течност, като натиснете върху стените на тръбата. Веднага след като тампонът се премине по цялата повърхност, без да останат незасегнати места, след това леко завъртете плаката и отново се засяват. Операцията се повтаря още 2 пъти.

Оставете да престои 10 минути и след това поставете антибиотичните дискове със стерилен форцепс, оставяйки пространство от 24 mm между тях. След като поставите всеки диск върху агара, натиснете леко всяка една със скобата, за да се уверите, че те са добре залепени.

След процеса, плаката се обръща и инкубира при 35-37 ° С в аеробиоза в продължение на 16 до 18 часа. Ако е взискателен микроорганизъм, може да се наложи микроаерофилия и ако антибиограмата съдържа дискоциклинови дискове, тя трябва да се чете на 24 часа.

Използва се линийка за измерване на диаметъра на всеки ореол. Резултатите трябва да бъдат записани в mm. Впоследствие получените стойности се свързват с таблиците на точките на изрязване, публикувани от настоящото ръководство CLSI.

Докладвайте като чувствителен (S), междинен (I) или резистентен (R), според случая.

Антибиотиците се подбират според изолирания микроорганизъм и вида на инфекцията, която се среща.

Понякога стратегическото поставяне на антибиотици трябва да се разглежда, за да се покажат фенотипните модели на резистентност.

Стратегическо поставяне на дискове на агара Müeller Hinton

За ентеробактериите дискът клавуланова киселина трябва да се постави пред цефалоспорините от трето и четвърто поколение. Увеличаването на яйцевидна форма показва, че щамът е производител на бета-лактамази с разширен спектър (ESBL). Това означава, че пациентът не трябва да се лекува с какъвто и да е цефалоспорин.

При стафилококите е важно еритромицинът или дискът на азитромицин да се поставят пред клиндамициновия диск (D-тест)..

Резистентният хало в еритромицин и сплескването в хало на клиндамицин показва, че щамът има индуцируема устойчивост към клиндамицин, щам (RIC). Това означава, че лечението с клиндамицин няма да бъде ефективно.

За търсене на индуцируеми щамове AMP C в Enterobacteriaceae и някои неферментиращи Грам отрицателни бацили, дисковете на цефтазидим, цефокситин или пиперацилин тазобактан са изправени пред имипемен диск, на разстояние 27 mm.

Ореол, сплескан в един от дисковете, обърнати към имипенем, показва наличието на индуцируем AMP С.

За търсенето на конститутивен АМР С, 500 μg диск с клоксацилин се среща с цефтазидим (30 μg) и с цефотаксим (30 μg) на разстояние 25 mm. Разширеният ореол в един от цефалоспорините показва положителност.

Дискът клоксацилин може също така да бъде заменен с 9 mm диск от Whatman No. 6 филтърна хартия, импрегнирана с фенилборна киселина (400 μg) с разстояние от 18 mm. То се тълкува като предишното.

И накрая, да се изследва производството на метало-бета-лактамази, особено в Pseudomonas aeruginosa, Диск, импрегниран с 10 μl етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA 750 μg) и тиогликолова киселина (SMA 300 μg), с лице на имипенем и меропенем, се използва на разстояние 15 mm.

Тестът е положителен, ако има разширяване на имипенем или меропенем халоса към диска EDTA / SMA. Този резултат трябва да бъде потвърден от модифицирания тест на Ходж.

Този метод се състои в инокулиране на щам Escherichia coli ATCC 25922 върху плочата на Müeller Hinton. В центъра на плочата се поставя диск от имипенем и след това се прави флейта от диска към периферията с напрежението на P. aeruginosa подозрително. Можете да тествате до 4 щама на табела.

Тестът ще бъде положителен, ако има зона на изкривяване на ореола на имипенем около стрията.

Причини за грешни резултати

-Дисковете с лошо запазени антибиотици могат да произведат фалшиво съпротивление. Например, оксацилиновият диск е много уязвим за температурни промени.

-РН на средата под посочената киселина (киселина) води до по-малки ореоли в аминогликозидите и макролидите (риск от фалшива резистентност) и по-големи ореоли в пеницилин, тетрациклин и новобиоцин (риск от фалшива чувствителност)..

-Ако рН е над посоченото (алкално), описаните по-горе ефекти се обръщат.

-Среда с високи концентрации на тимин и тимидин влияе значително върху понижаването на инхибиторните ореоли на сулфонамиди и триметоприми..

-Високите концентрации на калций и магнезий произвеждат фалшива резистентност на аминогликозиди, полимиксин В и тетрациклини срещу щамове на Pseudomonas aeruginosa.

-Ниските концентрации на калций и магнезий предизвикват фалшива чувствителност на аминогликозиди, полимиксин В и тетрациклини срещу щамове на Pseudomonas aeruginosa.

-Наличието на цинк влияе върху резултатите от дисковете карбапенеми (имипенем, меропенем и ертапенем)..

-Дебелината на средата под 3 mm дава резултати за фалшива чувствителност, докато дебелина над 5 ще доведе до фалшиво съпротивление.

-Мобилизирането на дисковете в антибиограмата ще даде деформирани ореоли, тъй като освобождаването от антибиотик е незабавно.

- Много слаби инокулуми влияят на резултатите, тъй като няма да има равномерно или сливане на растежа в агара, което е необходимо условие за измерване на зоните на инхибиране, в допълнение към факта, че ореолите могат да дадат по-голямо от нормалното.

-Претоварената инокула може да даде по-малки ореоли от нормалното.

-Неспазването на разстоянието между дисковете кара един ореол да се припокрива с друг и не може да се чете правилно.

-Инкубирайте с СО₂ увеличава размера на ореолите на тетрациклинови и метицилинови дискове.

-Инкубацията при температури под 35 ° С води до по-големи ореоли.

-Добавянето на кръв намалява размера на ореола на сулфонамидите.

ограничение

Чувствителността на антибиотик, демонстриран в антибиограма срещу микроорганизъм (in vitro) не е гаранция, че ще работи in vivo.

Контрол на качеството

За да се разбере дали средата съдържа правилното количество тимин, трябва да се засее щам Enterococcus faecalis ATCC 29212 и тест за чувствителност към триметоприм сулфаметоксазол (SXT), той трябва да даде хало, равен на> 20 mm, за да бъде задоволително.

препратки

1. - Агар Мюлер-Хинтън. Уикипедия, Свободната енциклопедия. 16 ноември 2018, 12:23 UTC. 27 януари, 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld А. (2009). Микробиологична диагноза на Bailey & Scott. 12 изд. Редакция Panamericana S.A. Аржентина.
3. Кона Е. Условия за добро проучване на чувствителността чрез агар дифузионен тест. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratory. Мюлеровият агар с 5% овча кръв. 2009. Налично на: http://f-soria.es
5. Агар лаборатория BD Müeller Hinton II. 2017. На разположение на адрес: .bd.com
6. Laboratories Britania. Агар от Müeller Hinton. 2015. Налично на: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологична диагноза. 5-то изд. Редакция Panamericana S.A. Аржентина.
8. Martínez-Rojas D. Betalactamasas тип AmpC: Общи и методи за фенотипно откриване. Rev. Soc. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Достъпни на: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Фенотипно откриване на металобеталактамази в клинични изолати на Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Достъпни на: scielo.org.