Основи, материали, техника и приложения за оцветяване на Giemsa



на Гимза петно е вид оцветяване на клинични проби, основано на смес от кисели и основни багрила. Създаването му е вдъхновено от работата на Романовски, където Густав Гимзе, химик и бактериолог, първоначално от Германия, го усъвършенства чрез добавяне на глицерол за стабилизиране на съединенията..

Промените, генерирани в оригиналната техника на Романовски, позволяват значително да се подобрят микроскопичните наблюдения, поради което техниката се кръщава с името на оцветяването на Giemsa..

Тъй като това е проста техника за изпълнение, много функционална и икономична, понастоящем тя се използва широко в клиничната лаборатория за хематологични мази, проби от костен мозък и тъканни срезове..

Техниката на оцветяване на Giemsa е много полезна за цитологични изследвания, тъй като позволява наблюдение на специфични структури на клетките. Тази техника оцветява цитоплазмите, ядрата, ядрата, вакуолите и гранулите на клетките, като е в състояние да различи дори фини следи от хроматин..

Освен това могат да бъдат открити значителни промени в размера, формата или оцветяването на ядрото, където е възможно да се визуализира загубата на връзката между ядрото и цитоплазмата..

От друга страна, тя позволява да се идентифицират незрели клетки в костния мозък и периферната кръв, които са важни за диагностицирането на сериозни заболявания като левкемия. Възможно е също така да се открият хемопаразити, екстра и вътреклетъчни бактерии, гъбички, наред с други.

В цитогенетиката тя е доста използвана, тъй като е възможно да се изследва митозата на клетките.

индекс

  • 1 Основа на оцветяването на Giemsa
  • 2 Материали
    • 2.1 Материали за приготвяне на основния разтвор
    • 2.2. Режим на приготвяне на основния разтвор
    • 2.3 Материали за приготвяне на буферния разтвор
    • 2.4 Крайна подготовка на багрилото
    • 2.5 Допълнителни материали, необходими за оцветяване
  • 3 Техника
    • 3.1 Процес на оцветяване
  • 4 Комунални услуги
    • 4.1 Хематология
    • 4.2 Микология
    • 4.3 Бактериология
    • 4.4 Паразитология
    • 4.5 Цитология
    • 4.6 Цитогенетика
  • 5 Изследвания, демонстриращи ефективността на оцветяването на Giemsa
  • 6 Препоръки за добро оцветяване
  • 7 Често срещани грешки в оцветяването на Giemsa
    • 7.1 Изключително синьо оцветяване
    • 7.2 Прекалено розово оцветяване
    • 7.3 Наличие на преципитати в замазката
    • 7.4 Наличие на морфологични артефакти
  • 8 Режим на съхранение
  • 9 Препратки

Основа на оцветяването на Giemsa

Багрилата тип Romanovsky се основават на използването на контраст между кисели и основни багрила, за да се постигне оцветяване на основните и киселинни структури, съответно. Както може да се види, има афинитет на киселите багрила за боядисване на основните структури и обратно.

Основната използвана боя е метиленово синьо и неговите окислени производни (Azure A и Azure B), докато киселинното багрило е еозин.

Киселинните структури на клетките са нуклеиновите киселини, гранулите на сегментираните базофили, между другото, следователно те ще бъдат оцветени с метиленово синьо.

В същия смисъл, основните структури на клетките са хемоглобин и някои гранули, като тези, съдържащи се в сегментираните еозинофили, между другото; те ще бъдат боядисани с еозин.

От друга страна, поради факта, че метиленово синьо и лазурно се характеризират с метахромни багрила, те могат да осигурят променлив тон на различните структури в зависимост от натоварването на полианиони, които притежават..

По този начин стратегическата комбинация от основни и киселинни багрила е в състояние да развие широк спектър от цветове, в зависимост от биохимичните характеристики на всяка структура, преминавайки през бледосини, тъмносини, лилави и лилави тонове в случая на кисели структури..

Докато оцветяването, осигурено от еозин, е по-стабилно, като се получават цветове между червеникаво-оранжево и сьомга.

материали

Материали за приготвяне на основния разтвор

Приготвянето на основния разтвор изисква с тегло 600 mg прахообразно багрило Giemsa, измерване на 500 cc метилов алкохол без ацетон и 50 cm3 неутрален глицерин..

Режим на приготвяне на основния разтвор

Поставете тежкия прах Giemsa в хоросан. Ако има бучки, те трябва да се напръскат. След това се добавя значително количество от измерения глицерин и се смесва много добре. Получената смес се изсипва в много чиста кехлибарена бутилка.

Останалата част от глицерина се поставя в хоросан. Смесва се отново, за да се почисти останалата боя, която е залепнала за стените на хоросана, и се излива в същата бутилка.

Бутилката се покрива и се пренася в продължение на 2 часа във водна баня при 55 ° С. Докато сте в баня с вода, леко разбъркайте сместа на всеки половин час.

След това сместа се оставя да се охлади до поставяне на алкохол. Преди това част от измерения алкохол се поставя в хоросан, за да се довърши измиването на остатъка от оцветителя и след това се добавя към сместа заедно с останалата част от алкохола..

Този препарат трябва да бъде оставен да узрее за поне 2 седмици. Частта, която се използва от основния разтвор, трябва да се филтрира.

За да се избегне замърсяване на препарата, препоръчва се да премине частта, която ще се използва постоянно, в малка кехлибарена бутилка с капкомер. Презареждайте всеки път, когато реагентът изтече.

Материали за получаване на буферния разтвор

От друга страна, буферен разтвор при рН 7.2 се получава, както следва:

6,77 грама натриев фосфат (безводен) се претеглят (NaHPO4), 2,59 g калиев дихидроген фосфат (KH)2PO4) и дестилирана вода до 1000 cc.

Окончателна подготовка на багрилото

За получаването на крайния разтвор за оцветяване се измерва 2 см от филтрирания изходен разтвор и се смесва с 6 см от буферния разтвор. Сместа се разбърква.

Съответният факт, който трябва да се вземе предвид, е, че техниките за приготвяне на багрилото могат да се променят според търговската къща.

Допълнителни материали, необходими за оцветяване

Освен описаните материали, той трябва да бъде снабден с цветни мостове, водни решетки или буфер за измиване, листове за предмети или капаци, хронометър за контрол на времето за оцветяване и попивателна хартия или някакъв материал, който може да се използва за изсъхване ( марля или памук).

техниката

Процес на оцветяване

1) Преди оцветяване, трябва да имате пробата, която да се разпръсне върху чист предмет..

Пробите могат да бъдат кръв, костен мозък, разрези на хистологични тъкани или цервикагинални проби. Препоръчва се външните части да бъдат тънки и да имат 1 или 2 часа сушене, преди да ги оцветят.

2) Всички листове, които трябва да оцветите, се поставят върху цветни мостове. Винаги работете в същия ред и идентифицирайте всеки лист добре.

3) Поставят се няколко капки от 100% метилов алкохол (метанол) върху намазката и се оставят за 3 до 5 минути, за да се фиксира и дехидратира пробата..

4) Изхвърлете метанола в листа и оставете да изсъхне на въздух.

5) След като изсъхне, поставете крайния разтвор за оцветяване с капкомер, докато целият лист е покрит. Оставете за 15 минути. Някои автори препоръчват до 25 минути. Зависи от търговската къща.

6) Източете багрилото и измийте намазката с дестилирана вода или с 7.2 буферен разтвор.

7) На попивателна хартия оставете листата да изсъхнат на открито, подредени вертикално с помощта на опора.

8) Избършете гърба на слайда с марля или памучен тампон, напоен с алкохол, за да отстраните оставащото багрило.

комунални услуги

Техниката на оцветяване на Giemsa се използва в няколко области, включително: хематология, микология, бактериология, паразитология, цитология и цитогенетика.

хематология

Това е най-честата полезност, която се дава на това оцветяване. С него можем да идентифицираме всяка една от клетките, представени в проби от костен мозък или периферна кръв. Както и оценяване на броя на всяка серия, способност за откриване на левкоцитоза или левкопения, тромбоцитопения и др..

Тъй като е чувствителен за идентифициране на незрели клетки, той има значение при диагностицирането на остри или хронични левкемии. Също така е възможно да се диагностицира анемия, като например сърповидно-клетъчна болест, сърповидно-клетъчна болест, наред с други..

микология

В тази област е обичайно да го използвате за търсене Histoplasma capsulatum (вътреклетъчен диморфен гъби) в тъканни проби.

бактериология

При хематологични натривки, оцветени с Giemsa, е възможно да се открият Borrelias sp при пациенти, които имат заболяване, наречено рецидив на треска. Спирохетите са многобройни сред еритроцитите, в проби, взети на фебрилния пик.

Възможно е също така да се визуализират вътреклетъчните бактерии като Rickettsias sp и Chlamydia trachomatis в инфектирани клетки.

паразитология

В областта на паразитологията оцветяването с Giemsa позволява диагностицирането на паразитни заболявания като малария, болест на Chagas и лейшманиоза..

В първите две паразити Plasmodium sp и Trypanosoma cruzi те могат да бъдат визуализирани в периферната кръв на заразените пациенти, те могат да бъдат намерени в различни етапи в зависимост от фазата, в която е заболяването..

За да се подобри търсенето на кръвни паразити, се препоръчва да се използва оцветяване с Giemsa, смесено с боята May-Grünwald.

По същия начин, кожен лейшманиоза може да се диагностицира, когато се оценяват проби от кожни биопсии, оцветени с Giemsa, където се намира паразитът..

цитология

Оцветяването с Giemsa се използва и за цитологично изследване на ендоцервикални проби, въпреки че не е най-често използваната техника за тази цел..

Но в случаите на недостиг на ресурси може да се използва функционалност, подобна на тази на техниката Papanicolaou и на по-ниска цена. Въпреки това, той изисква опит от страна на проверителя.

цитогенетика

Съществена характеристика на оцветяването с Giemsa е способността му да се свързва силно с региони, богати на ДНК аденини и тимини. Това позволява ДНК да се визуализира по време на митозата на клетките в различни състояния на кондензация.

Тези проучвания са необходими за откриване на хроматични аберации като дупликации, делеции или транслокации на различните региони на хромозомите..

Изследвания показват ефикасността на оцветяването с Giemsa

Cannova et al (2016), сравняват 3 техники за оцветяване за диагностициране на кожен лейшманиоза.

За тази цел те са използвали проби, получени от експериментално животно (Mesocrisetus auratus) експериментално инокулирани с Leishmanias.

Авторите показват, че оцветяването с Giemsa е по-добро от оцветяването на Pap-mart® и Gaffney. Затова те считат, че оцветяването на Giemsa е идеално за диагностициране на кожен лейшманиоза.

Отличните резултати, получени от авторите, се дължат на факта, че комбинацията от багрила, съставляващи сместа на Giemsa, осигурява необходимите условия за създаване на благоприятен контраст, позволявайки ясно да се разграничат амастиговите структури, както вътре, така и екстрацелуларно..

Другите техники (Pap-mart® и Gaffney) също го направиха, но по-слаб и следователно по-трудно да се визуализират. Ето защо оцветяването на Giemsa се препоръчва за паразитологична диагностика на лейшманиоза.

По същия начин, изследване на Ramírez et al (1994), оценява валидността на петна от Giemsa и Lendrum в конюнктивалните петна за идентифициране на Chlamydia trachomatis.

Авторите установяват, че оцветяването на Giemsa и Ledrum има една и съща специфичност, но Giemsa е по-чувствителен.

Това обяснява защо понастоящем оцветяването с Giemsa е най-често използвано за диагностициране на хламидиални инфекции, особено ако има малко ресурси.

Препоръки за добро оцветяване

Изсушаването на листата не трябва да се ускорява. Времето за предпазливост трябва да се изчака за изсушаване на открито. Приблизително 2 часа.

Оцветете веднага след 2 часа за най-добри резултати.

За по-добро фиксиране и оцветяване на замазките, пробата трябва да се разпредели по листа по такъв начин, че да остане тънък и равномерен слой..

Предпочитаната кръвна проба е капилярната, тъй като намазката се прави директно от капка кръв и следователно пробата няма добавка, която благоприятства поддържането на клетъчни структури..

Въпреки това, ако се използва венозна кръв, EDTA трябва да се използва като антикоагулант, а не като хепарин, тъй като последната обикновено деформира клетките..

Често срещани грешки в оцветяването на Giemsa

В практиката на това оцветяване могат да се правят грешки. Те се доказват от внезапни промени в нюансите на структурите.

Изключително синьо оцветяване

Може да се дължи на:

  • Много гъсти петна
  • Превишаване на времето за оцветяване
  • Твърде малко измиване.
  • Използване на реактиви, които са над неутралното рН (алкално).

При тези условия цветовете на следните структури са изкривени, така че еритроцитите вместо умират розово-сьомга ще изглеждат зелени, гранулите на еозинофилите, които трябва да бъдат боядисани в червена тухла, ще станат сини или сиви и т.н. отклонение в обичайните тоналности.

Прекалено розово оцветяване

Може да се дължи на:

  • Недостатъчно време на оцветяване.
  • Продължително или прекомерно измиване.
  • Лошо сушене.
  • Използване на много киселинни реактиви.

В този конкретен случай структурите, които обикновено са оцветени в синьо, няма да бъдат почти видими, докато структурите, които са оцветени в розово, ще имат много преувеличени тоналности..

Пример: еритроцитите ще имат яркочервен или силен оранжев цвят, ядреният хроматин ще изглежда бледо розов, а гранулите на еозинофилите ще станат ярко червени..

Наличие на преципитати в намазката

Причините могат да бъдат:

  • Използвайте замърсени или лошо измити листове.
  • Не позволявайте размазването да се изсушава добре.
  • Оставете фиксиращия разтвор твърде дълго.
  • Неправилно измиване в края на оцветяването.
  • Неподходящо филтриране или нефилтрация на използваното багрило.

Наличие на морфологични артефакти

Морфологични артефакти могат да се появят в намазките, което затруднява визуализирането и интерпретирането на наличните структури. Това се дължи на:

  • Вид използван антикоагулант, като хепарин.
  • Използване на мръсни, повредени или мазни листове.

Режим на съхранение

След приготвяне, багрилото трябва да се съхранява при стайна температура (15 - 25 ° C), за да се предотврати утаяването на багрилото. Трябва да се съхранява в затворен кехлибарен контейнер.

препратки

  1. Cannova D, Brito E и Simons M. Оценяване на техники за оцветяване за диагностициране на кожен Leishmaniasis. Salus.  2016; 20 (2): 24-29.
  2. Реагенти на PanReac Applichem ITW. Гимза петно. Версия 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Кастелар дел Валес, Испания.
  3. Clark G. Оцветяване процедури (1981), 4 пъти. Уилямс и Уилкинс.
  4. Приложна клинична химия Giemsa боя за диагностика in vitro. Дистрибутор: cromakit.es
  5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F и Grazioso C. Валидността на петна от Giemsa и Lendrum в конюнктивалните петна за идентифициране на Chlamydia trachomatis. Bol на Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
  6. Касас-Ринкон Г. Обща микология. 1994. Второ издание на Universidad Central de Venezuela, Библиотечни издания. Венецуела, Каракас.
  7. - Гимза петно. Уикипедия, Свободната енциклопедия. 1 сеп 2017, 01:02 UTC. 6 декември 2018, en.wikipedia.org.