Основата, материалите, техниката и използваните петна на Райт



на Петното на Wrigth е оцветяваща техника, създадена от американския патолог Джеймс Хоумър Райт през 1902 г., от оцветяването на Романовски. Както петното на Романовски е нестабилно, Wrigth включва метанол като разтворител и фиксатор.

Това оцветяване е полихроматично, което означава, че генерира няколко цвята в зависимост от структурата, която боята абсорбира. Тази техника на оцветяване е широко използвана за извършване на диференциални броя на белите кръвни клетки и изследване на морфологията на червените кръвни клетки, тромбоцитите и левкоцитите в периферната кръв и костния мозък..

Неговото приложение е много важно, тъй като аномалии могат да се видят в различните клетъчни линии на кръвта, улеснявайки диагностицирането на заболявания като левкемия или бактериални или паразитни инфекции..

Може би това са най-често срещаните приложения, при които се използва тази техника, но те не са единствените. Той е полезен също и за проби, различни от кръв и костен мозък, като например проби от назален секрет, фекална слуз, слюнка, кожа, между другото..

индекс

  • 1 Основа на петното на Райт
  • 2 Материали
    • 2.1 Подготовка
    • 2.2 Буфериран буферен разтвор
    • 2.3 Допълнителни материали, необходими за извършване на оцветяването
  • 3 Компоненти на петното на Райт
    • 3.1 Метанол
    • 3.2 Амортисьор
    • 3.3 Eosin (Y)
    • 3.4 Метиленово синьо
  • 4 Техника
  • 5 Помощна програма
    • 5.1 Хематология
    • 5.2 Назална секреция
    • 5.3 Паразитология
    • 5.4 Респираторни инфекции
    • 5.5 Бактериология
    • 5.6 Микология
  • 6 Как се наблюдават структурите на кръвната проба с петното на Райт??
  • 7 Препоръки за добро оцветяване
  • 8 Често срещани грешки в оцветяването на Wrigth
    • 8.1 Много бледо оцветяване
    • 8.2 Преципитати на оцветителя
    • 8.3 Намазване с изключително червеникаво или синьо оцветяване
  • 9 Режим на съхранение
  • 10 Препратки

Основата на петното на Райт

Петното на Райт е родено от петното на Романовски, което се състои от разтвор на метилов алкохол от киселинен багрило (еозин Y) и основен (метиленово синьо) и неговите продукти за окисляване..

Сместа от багрила, използвани в петното на Райт, причинява ефекта, известен като Романовски, т.е. осигурява красиво пурпурно оцветяване на ядрата на левкоцитите и неутрофилните гранули, докато червените кръвни клетки са оцветени в розово..

Компонентите, отговорни за даване на цветовата гама, типична за петното на Райт, са сини В и еозин Y. Наблюдаваният ефект ще зависи от свързването на багрилата с химическите структури и взаимодействията на синьо В и еозина Y..

Киселинни структури като нуклеинови киселини, ядрени протеини и реактивна незряла цитоплазма на някои видове клетки, фиксиращи синьо В (основна боя).

Докато основните структури като хемоглобин, гранулите на сегментираните еозинофили, наред с други клетъчни структури, фиксират еозина Y (киселинна боя).

Резултатът от оцветяването може да бъде повлиян от различни фактори, като рН на багрилото Wright, буфера и промивния разтвор; както и времето за оцветяване и фиксиране.

Ето защо, всяка стъпка в подготовката на реагентите е от решаващо значение и трябва да се направи, като се внимава за всеки детайл.

материали

Оцветяване на Райт. За 100 mL се изисква:

Претеглят се 0,3 g боя Wright, измерват се 97 ml метанол и 3 ml глицерол.

подготовка

В хаван поставете тежкото количество багрило на Райт и бавно добавете глицерола, докато прахът се разтвори напълно..

След това се добавя метанолът, смесва се и се излива в кехлибарена бутилка.

Преди употреба разтворът трябва да се разклати с леки движения и да се филтрира.

Буферен буфер

В литър дестилирана вода, 3,76 g динатриев хидрофосфат (Na2НРО4   2H20) плюс 2,1 g калиев дихидроген фосфат (KH)2PO4).

Разбърква се много добре, докато всички включени реагенти се разтворят. Регулирайте рН до 7.2. Изсипва се в стъклен буркан и се съхранява при стайна температура.

Допълнителни материали, необходими за оцветяване

Освен това са необходими други материали за извършване на оцветяването, те са: листове, носещи предмети или покриващи предмети, мост от оцветяване, pisetas с вода или буфер за измиване, хронометър, за да се вземе времето на оцветяване и някои сушилен материал (абсорбираща хартия, марля или памук).

Компоненти за петна на Wright

метанол

Алкохолът (метанол) служи като фиксатор на кръвната намазка върху слайда.

Основно това е редуциращ реагент, дехидратор и фиксатор на коагулант. Следователно, неговата функция е да коагулира протеините и да ги направи неразтворими, но без да ги денатурира.

Метанолът е най-широко използваният реагент за фиксиране на петна във всички лаборатории, тъй като осигурява по-добри резултати от тези, получени с етанол. Идеалната концентрация е 99%.

Амортисьорът

Буферът (буфериран разтвор) има функцията да регулира или поддържа рН на багрилото, тъй като рН, коригирано до 7.2, е от съществено значение за клетъчните структури да абсорбират правилно багрилата.

От друга страна, преминаването на фиксация на метанол дехидратира клетките и буферът им помага да ги рехидратира.

Eosin (Y)

Еозинът има афинитет към основните компоненти, защото той е киселинен багрило. Два вида еозин са много сходни една с друга, така че може да се използва едното от двете, получавайки същия резултат.

Единият се нарича еозин Y, жълт еозин или тетрабромофлуоресцеин и другият еозин В, синкав еритрозин В или дибромодинитрофлуоресцеин. Обаче, еозин Y е най-често използваният.

Най-важното свойство на това багрило е неговата отрицателна полярност, което я прави привлечена от клетъчни структури с положителен заряд.

Метиленово синьо

Това е основният оцветител. Неговото основно свойство е метахромазията, т.е. не всички структури ще бъдат боядисани в един и същи цвят, зависи от химическия състав на структурите, които той оцветява..

Някои от тях ще станат светли или тъмносини, а други - тъмно лилави или бледолилави.

техниката

1-Извършете разпръскването на пробата така, че да остане тънък филм, върху слайд или покривно стъкло.

2-Оставете въздуха да изсъхне за около 2 часа.

3-Поставете сухото петно ​​върху оцветяващия мост или тавата за оцветяване с пробата, разпръсната нагоре.

4-Покрийте листа с багрилото Райт по капка, докато покрие цялата повърхност. Оставете за 5 - 8 минути.

5-Багрилото трябва изцяло да покрива плъзгача, без да се разлива по ръбовете. Ако по време на оцветяването започне да се изпарява, трябва да се поставят допълнителни капки.

6-Впоследствие добавете равно количество от амортисьора, раздуйте малко, докато се появи характерният метален блясък. Отделете 10 до 15 минути.

7-Измийте с чешмяна вода, поставяйки меката струя, докато листът изглежда розов.

8-С марля, напоена с алкохол, отстранете боята, прикрепена към гърба на слайда.

9 - Оставете намазката да изсъхне много добре, преди да поставите потапящото масло, за да го визуализирате в микроскопа.

полезност

хематология

Той е идеален за размазване на периферна кръвна натривка, за изследване на дебели кръвни мази и за изследване на клетки от проби от костен мозък..

Поради химичните свойства на тази комбинация от багрила, клетъчните структури могат лесно да бъдат разпознати, тъй като могат да различават различните типове присъстващи клетки..

Назална секреция

Тази техника е много полезна за идентифициране на клетките на назалната секреция (епителни клетки, сегментирани еозинофили, полиморфонуклеарни) при диагностицирането на алергичен ринит..

паразитология

В този смисъл той е бил полезен за изучаването на Leishmania sp в хистиоцитите на подкожната клетъчна тъкан при кожни язви. По същия начин, той се използва за идентифициране на левкоцити в проби от изпражненията (фекален левкограма).

В този случай е от интерес за лекаря да знае дали левкоцитозата в изпражненията е от полиморфноядрен или мононуклеар. Това откритие в фекалната левкограма ще ръководи, ако е бактериална или вирусна инфекция съответно.

От друга страна, паразитите, които циркулират в кръвта, могат да бъдат намерени вътре в еритроцитите или свободни в плазмата. Желаните паразити са Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii и филарии, а във ветеринарната медицина е полезно при търсенето Theileria equi и Babesia caballi, причинители на бебета, особено при еднокопитни.

Оцветяването на Wright и Giemsa може да диференцира хемопаразитите от нормалните клетъчни компоненти. За тази цел можете да използвате два вида спредове:

Изящни участъци

Кръвта се разстила като тънък филм върху слайд. Оцветени с петна на Райт, разкриващи характеристиките на ядрото и цитоплазмата.

Дебела капка

Тази методология се използва за изследване на наличието на паразити в по-голямо количество кръв.

За целта върху слайд се поставя голяма капка кръв. След като сте там, трябва да дефибринирате, като правите по-големи и по-големи кръгове от центъра навън, като използвате ръба на друг слайд.

Накрая, за да се наблюдават паразитите в гъстата мазка, еритроцитите трябва да се лизират с вода.

Респираторни инфекции

На дихателното ниво тази техника е полезна, тъй като клетките, намиращи се в проби от храчки, бронхиален или бронхоалвеоларен лаваж, са важни за установяване на диагнозата..

По същия начин тук могат да се различат полиморфонуклеарните клетки и мононуклеарните клетки.

бактериология

Използването на тази техника в бактериологията е ограничено, тъй като не е добро за оцветяване на бактериите, поради което при оцветяването им се използват други специализирани техники за оцветяване..

Въпреки това, той е бил използван за търсене на епителни клетки с включени тела Chlamydia trachomatis на уретрална или ендоцервикална лигавица, въпреки че трябва да се признае, че това не е най-добрият метод за.

Възможно е също така да се наблюдават спираловидни бактерии сред червените кръвни клетки като Borrelia burgdorferi при инфектирани пациенти, както и в морули или включени тела на Ehrlichia sp в цитоплазмата на лимфоцити, моноцити или неутрофили в намазан кръв.

микология

на Histoplasma capsulatum е патогенна гъба, често диагностицирана чрез микроскопско наблюдение на различни тъканни проби, оцветени с петна на Wright.

Как се наблюдават структурите на кръвната проба с петното на Райт?

Препоръки за добро оцветяване

Удължаването на кръвните проби трябва да се изсуши на въздух спонтанно. Мазите трябва да са възможно най-тънки, за да се постигне по-добро фиксиране на багрилото и да се избегнат преколорации.

За боядисване с високо качество е препоръчително оцветяването да се извърши в рамките на два часа след приготвянето на намазката. От друга страна, идеалната проба е капилярната кръв, без антикоагулант.

Ако се използва венозна кръв, тя трябва да се използва като антикоагулант на EDTA, а не като хепарин, тъй като последната може да деформира клетъчните структури.

За да се предотврати влошаването на готовия оцветител трябва да се съхранява в сухи места.

По време на процеса на измиване се препоръчва използването на вода, коригирана до неутрално рН.

Накрая, препоръчително е да се тестват методите за боядисване, които се използват в лабораторията всеки път.

Това се извършва чрез боядисване на проби или удължени модели, като качествен контрол. Тази стъпка е важна, тъй като това гарантира, че оцветяването е правилно приготвено и времето на оцветяване е добре стандартизирано.

Ако шаблонът е силно оцветен, има проблеми, които трябва да бъдат решени.

Често срещани грешки в оцветяването на Wrigth

Много бледо оцветяване

Много бледи петна, обикновено поради много кратко време на оцветяване или много преувеличено измиване. Тя се коригира чрез удължаване на времето за контакт с багрилото или чрез намаляване на времето за измиване.

Багрилото утаява

Наличието на преципитати в боя може да има няколко причини, но най-честите причини за това са: използване на нефилтрирано багрило, оцветяване на неравномерни оцветяващи мостове, използване на мръсни листове с прах или грес, без да се прави добро измиване Завършете оцветяването.

Намажете с изключително червеникаво или синьо оцветяване

Буферът е отговорен за рН на оцветителя. Оцветители с рН под посоченото (киселинно) ще доведат до много червени петна.

Ако рН на багрилото е над (алкално), ще се получи изключително синкава намазка.

Режим на съхранение

Реагентът трябва да се съхранява при стайна температура.

препратки

  1. Gutiérrez V. Сравнително проучване между метода на оцветяване на Райт и Elisa тест за диагностика на Ehrlichiosis canina в град Сан Педро Сула, Хондурас. 2008. Дипломна работа за кандидатстване за Звание ветеринарен лекар. Университет Сан Карлос де Гватемала.
  2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Основно оцветяване в микробиологичната лаборатория. Проучване на уврежданията. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. - Петното на Райт. Уикипедия, Свободната енциклопедия. 18 май 2018 г., 12:05 UTC. 8 декември 2018, 20:37
  4. Calderón A, Cardona J, Vergara. Честота на. \ T Babesia spp. с коне от Монтерия, Кордоба (Колумбия). Обр.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Микробиологична диагноза на Bailey & Scott. 12 изд. Аржентина. Panamericana S.A Редакция.
  6. Retamales Е, Mazo V. Институт по обществено здраве Правителството на Чили. Препоръки за оцветяване на кръвни намазки за отчитане на кръвната картина.